RACK1突變體在哺乳動物細胞中的表達及定位研究

朱亮亮，韓 盧，王蓓華，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌

?

RACK1突變體在哺乳動物細胞中的表達及定位研究

朱亮亮，韓 盧，王蓓華，耿慧武，潘林鑫，劉曉穎，范禮斌1

目的 根據活化蛋白激酶C受體1(RACK1)的蛋白結構，構建其缺失突變體的真核表達質粒，研究RACK1缺失突變體在真核細胞內的表達及定位改變。方法 根據RACK1蛋白的結構域特點，以pcDNA3.1-RACK1-FLAG為模板，構建真核表達質粒pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG；Western blot檢測上述重組質粒在HEK 293T細胞中的表達；免疫熒光技術檢測RACK1的各缺失突變體在COS7細胞中的定位情況。結果 成功構建了RACK1各缺失突變體的真核表達質粒；Western blot結果表明，除pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG外，其余缺失突變體在HEK 293T細胞中均有效表達；免疫熒光實驗表明RACK1缺失突變體在COS7細胞中主要定位在胞質，細胞核中也有少量分布。結論 成功構建了RACK1缺失突變體真核表達質粒，并在HEK 293T和COS7細胞中成功表達；在COS7細胞中不同缺失突變體的表達定位均有差異，與野生型的RACK1相比也有所不同，表明缺失不同的結構域后其在細胞中的定位表達也發(fā)生了改變。這為研究RACK1各結構域的功能提供了重要依據。

突變體；質粒構建；免疫熒光；Western blot；結構域

活化蛋白激酶C受體1(the receptor for activated C kinase 1，RACK1)是由7個WD40(Trp-Asp)重復結構域組成的36 ku的細胞內支架蛋白，首先是作為錨定蛋白并激活胞內受體蛋白激酶C(PKC)被報道[1]，且能與PKCβ Ⅱ相互作用[2]。RACK1也命名為鳥嘌呤核苷酸結合蛋白β亞基類似物1(GNB2L1)，確定為WD40結構域蛋白家族成員，在大分子復合物中廣泛存在[3]。RACK1可以與不同的信號分子如PER1、PKCe、Src相互作用，并作為多種蛋白質與蛋白質相互作用的平臺[4-7]。對于許多激酶和受體來說RACK1作為一種支架蛋白，在許多生物反應中起著至關重要的作用，包括免疫應答、細胞生長、黏附、遷移和分化等[8-10]。該研究根據RACK1的7個WD40重復結構域，對其進行逐個缺失，并構建重組質粒。了解各缺失突變體的表達及定位情況，比較各缺失突變體與野生型的差異，進一步探索各結構域的不同功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、菌株等 HEK 293T、COS7、感受態(tài)E.coliTG1細胞、真核表達載體pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-RACK1-FLAG均為安徽醫(yī)科大學生物教研室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 Prime Star酶購自日本TaKaRa公司；限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ、T4 DNA連接酶及Lambda DNA EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker購自加拿大Fermentas公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自美國Axygen公司；Plasmid Mini Kit 購自美國Omega Bio-TEK公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自北京賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000、Opti-MEM購自美國Invitrogen公司；FLAG M2單抗購自美國Sigma公司；TRITC/FITC標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；熒光封片膠購自丹麥DAKO公司；PVDF膜購自加拿大BioBasi公司；ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司；熒光顯微鏡(Leica DMI 6000型)購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 運用NCBI數據庫分析 RACK1序列，劃分RACK1的7個WD40區(qū)域。RACK1是G蛋白β亞基的高度同源物，根據G蛋白β亞基的晶體結構使用PyMOL軟件繪制RACK1的三維結構彩圖。

1.2.2 缺失突變體的構建 根據目的基因序列和引物設計原則設計特異性引物，引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，具體引物設計見表1。以pcDNA3.1-RACK1-FLAG為模板，使用廠商推薦的PCR反應程序用Prime Star酶擴增目的序列，產物由瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠回收試劑盒回收純化。擴增產物以及真核表達載體pcDNA3.1(+)用限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ進行酶切。酶切產物經T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜；連接產物轉化到感受態(tài)細胞TG1，均勻涂布于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)皿上，37 ℃倒置培養(yǎng)8～12 h；挑取單克隆于含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃震蕩過夜；SDS堿裂解法抽提質粒并酶切鑒定，選擇1管鑒定正確的質粒送通用生物系統(安徽)有限公司測序。

1.2.3 細胞培養(yǎng) COS7細胞和HEK 293T細胞均在含5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入雙抗(青霉素、鏈霉素)并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.4 瞬時轉染 蛋白表達實驗中，待轉染前1 d接種的HEK 293T細胞長至80%～90%的匯合度時，按照脂質體LipofectamineTM2000的說明書將重組質粒瞬時轉染于細胞中，培養(yǎng)48 h。在熒光定位實驗中，轉染前1 d在35 mm的培養(yǎng)皿中置蓋玻片接種的細胞長至40%～50%的匯合度時，將重組質粒瞬時轉染于細胞中，培養(yǎng)24 h。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 轉染48 h后收集細胞，將細胞懸浮于細胞裂解液中4 ℃混旋裂解0.5～1 h,4 ℃、14 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀；取50 μl上清液與等量2×SDS上樣緩沖液混合，沉淀中直接加入適量2×SDS，沸水浴煮5 min，12 000 r/min離心5 min后進行SDS-PAGE電泳；電泳結束后100 V恒壓電轉1 h；室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜2 h，FLAG 一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次(每次10 min)；二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次(每次15 min)；于暗室中ECL顯色試劑盒顯影。

1.2.6 免疫熒光 COS7細胞轉染24 h后取出蓋玻片，用預冷的PBS洗去殘留的培養(yǎng)基后，分別用甲醇和70%的乙醇溶液固定細胞；1%脫脂奶粉溶液封閉30 min；FLAG一抗(1 ∶200，用封閉液稀釋)室溫孵育2 h；TRITC標記的山羊抗小鼠IgG 二抗(1 ∶200，用TBST稀釋)室溫孵育1 h；0.15 g/L DAPI溶液染核；熒光封片膠Dako將蓋玻片封于載玻片上。4 ℃儲存過夜，用共聚焦熒光顯微鏡觀察其定位。

2 結果

2.1 RACK1三維結構圖像和結構域分區(qū) RACK1是G蛋白β亞基的同源物，根據其晶體結構用PyMOL軟件繪制RACK1的三維結構圖。見圖1A，RACK1的結構是一個顯著不對稱的七葉片螺旋槳結構，并插入兩個顯著的回環(huán)，一個在葉片Ⅲ和Ⅳ之間另一個在葉片Ⅵ和Ⅶ之間，從晶體結構上看RACK1的N末端和C末端之間有部分交叉。依據NCBI數據庫分析RACK1的序列，將RACK1的317個氨基酸分成了不等的7個WD40結構域，并按照逐個缺失的方式構建了5個缺失突變體，見圖1B。

表1 引物序列

圖1 RACK1晶體結構和結構域圖

A：RACK1晶體結構(左邊是俯視圖，Ⅰ到Ⅶ每個葉片都貼上標簽并使用CHAINBOWs設計著色；右邊是側視圖)；B：RACK1結構域 野生型RACK1被分成7個不等的結構域，并以此設計5個突變體

2.2 RACK1缺失突變體PCR擴增產物及重組質粒的鑒定 對提取的重組質粒pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG；進行HindⅢ、EcoR Ⅴ酶切鑒定，經與Marker的比對表明連接成功，見圖2。測序結果進一步證實目的片段正確插入到pcDNA3.1(+)載體中。

2.3 RACK1突變體在哺乳動物細胞中的表達 對轉染了pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG的HEK293T細胞，48 h后收集細胞并進行Western blot檢測。如圖3A所示，除pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG外，其它突變體裂解液均檢測到相應的目的條帶。而在沉淀中所有的突變體均有表達，如圖3B所示。與蛋白Marker比較，條帶與預期的一致，即分別為30、25、20、15和10 ku。表明RACK1的5個缺失突變體均能在HEK 293T細胞中表達。

圖2 重組質粒酶切鑒定圖

M1：Lambda DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker；M2：TaKaRa DL2000 Marker；1：pcDNA3.1(+)載體酶切鑒定結果；2、8：pcDNA3.1-RACK1-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果；3、9：pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果；4、10：pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果；5、11：pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果；6、12：pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果；7、13：pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG的PCR產物和酶切鑒定結果

圖3 Western blot檢測RACK1突變體在哺乳動物細胞中的表達

A：轉染了相應缺失突變體的HEK 293T細胞裂解液；B：轉染了相應缺失突變體的HEK 293T細胞沉淀；1：pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG；2：pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG；3：pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG；4：pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG；5：pcDNA3.1-RACK1 (51-317)-FLAG

2.4 RACK1突變體在COS7細胞中的定位 轉染了RACK1突變體質粒的COS7細胞，24 h后取出進行免疫熒光制片并在熒光顯微鏡下觀察其定位。

圖4 RACK1突變體在COS7細胞中的定位 ×600

紅色：帶FLAG標簽的RACK1突變體蛋白；藍色：DAPI染色的細胞核；TRITC：FLAG熒光二抗；DAPI：細胞核染料；MERGE：組合圖

如圖4所示，pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG主要定位在細胞質并成點狀分布，細胞核中有極少表達；pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG與pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG在COS7細胞中的定位相同；pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG主要定位在細胞核中，但細胞質中也有部分點狀分布；pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG與pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG主要定位在細胞質中且成彌散式的分布，與其他突變體一樣在細胞核中也有部分表達，但相對量較多；在定位發(fā)生變化的同時，各突變體的表達量也發(fā)生了變化。隨著WD40區(qū)域的減少，RACK1突變體在COS7中的定位發(fā)生了一定的變化，可能是由于在減少WD40結構域的同時其酸堿性氨基酸發(fā)生了變化，導致其在細胞中的定位發(fā)生了變化。

3 討論

本研究設計并構建了5個帶FLAG標簽的RACK1缺失突變體，并分別將其轉染至HEK 293T和COS7細胞中，結果顯示，所有缺失突變體均能在HEK 293T細胞中表達，但pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG在上清液中不表達而在沉淀中表達，這可能是pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG在HEK 293T細胞中的細胞膜上表達，不能被溶解到裂解液中而留在沉淀中。在COS7細胞中，缺失突變體pcDNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG和pcDNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG主要成點狀分布在細胞質中，這可能是因為WD2和WD3區(qū)域含較多的酸性氨基酸，缺失突變體pcDNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG主要分布在細胞核中，但細胞質中也有少量點狀分布，這可能是因為WD4區(qū)域含較多的雙堿性氨基酸，這些缺失突變體與野生型RACK1的細胞定位相比有明顯的變化[11-12]；缺失突變體pcDNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG主要在胞質與核膜處成彌散型分布，細胞核中有少量分布，與野生型RACK1的細胞定位未發(fā)生明顯變化。隨著WD40結構域的缺失其細胞定位隨之也發(fā)生了變化，表明不同的WD40結構域對細胞定位可能有不同的影響。在定位發(fā)生變化的同時，各突變體的表達量也發(fā)生了變化，可能存在的原因有待進一步研究。

WD40蛋白廣泛存在于真核細胞中[11]，特別是在人源基因中[12]，其特征在于由40到60個不等的重復氨基酸組成，其內部含有兩個保守的肽序列，甘氨酸-組氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)[13-14]。含WD40的蛋白會參與諸如信號轉導，染色質修飾和轉錄調控的基本機制。RACK1含有7個重復的WD40區(qū)域，可能具備所有WD40蛋白家族的特征。與其相互作用的蛋白都特異性結合在特定的WD區(qū)域，如Src、PDE4D5、PKCβ、干擾素受體等的結合區(qū)域都在WD5-7范圍[15]。RACK1的WD6與WD7結構域能夠與pkd2L1的Ala19-Pro45片段相互作用。表明RACK1的不同WD40區(qū)域可能具備不同的功能。研究顯示野生型RACK1可與CLIC1蛋白相互作用，本研究表明在缺失不同的WD40區(qū)域后其仍可在哺乳動物細胞中表達，故可進一步研究RACK1的不同缺失突變體是否與CLIC1蛋白存在相互作用，以及相互作用的具體區(qū)域。

[1] Ron D, Mochly-Rosen D. Agonists and antagonists of protein kinase C function, derived from its binding proteins[J]. J Biol Chem,1994,269(34):21395-8.

[2] Ron D,Chen C H,Caldwell J,et al.Cloning of an intracellular receptor forprotein kinase C:a homolog of the beta subunit of G proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(3):839-43.

[3] Adams D R,Ron D,Kiely P A.RACK1, A multifaceted scaffolding protein:structure and function[J].Cell Commun Signal,2011,9:22.

[4] Hu L,Lu F, Wang Y, et al.RACK1,a novel hPER1-interacting protein[J].J Mol Neurosci,2006,29(1):55-63.

[5] Besson A,Wilson T L,Yong V W. The anchoring protein RACK1 links protein kinase C epsilon to integrin beta chains.Requirements for adhesion and motility[J].J Biol Chem,2002,277(24):22073-84.

[6] Chang B Y,Chiang M,Cartwright C A.The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1[J]. J Biol Chem,2001,276(23):20346-56.

[7] Sklan E H, Podoly E, Soreq H. RACK1 has the nerve to act: structure meets function in the nervous system[J]. Prog Neurobiol,2006,78(2):117-34.

[8] McCahill A,Warwicker J,Bolger G B,et al.The RACK1 scaffold protein: a dynamic cog in cell response mechanisms[J].Mol Pharmacol,2002,62(6):1261-73.

[9] Mamidipudi V, Dhillon N K, Parman T, et al. RACK1 inhibits colonic cell growth by regulating Src activity at cell cycle checkpoints[J].Oncogene,2007,26(20):2914-24.

[10]Berns H, Humar R, Hengerer B, et al. RACK1 is up-regulated in angiogenesis andhuman carcinomas[J]. FASEB J,2000,14:2549-58.

[11]Janda L,Tichy P, Spízek J, et al. A deduced Thermomonospora curvata protein containing serine/threonine protein kinase and WD-repeat domains[J]. J Bacteriol,1996,178(15):1487-9.

[12]Letunic I,Doerks T,Bork P. SMART:recent updates, new developments and status in 2015[J]. Nucleic Acids Res,2014, 43:257-60.

[13]Yu L,Gaitatzes C,Neer E,et al.Thirty-plus functional families from a single motif[J].Protein Sci,2000,9(12):2470-6.

[14]Van Nocker S, Ludwig P. The WD-repeat protein super family in Arabidopsis: conservation and divergence in structure and function[J].BMC Genomices,2003,4(1):50.

[15]McCahill A,Warwicker J,Bolger G B, et al.The RACK1 scaffold protein:a dynamic cog in cell response mechanisms[J]. Mol Pharmacol, 2002, 62(6):1261-73.

Expression and localization of RACK1 mutants in mammalian cell

Zhu Liangliang, Han Lu, Wang Beihua,et al

(DeptofBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmids of the receptor for activated C kinase 1 (RACK1) deletion mutants according to the protein structure of RACK1 and observe the expression and cellular localization of RACK1 mutants in the eukaryotic cells.MethodsAccording to the characteristics of RACK1 domains, the eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1-RACK1 (51-317)-FLAG, pcDNA3.1-RACK1 (93-317)-FLAG, pcDNA3.1-RACK1 (135-317)-FLAG, pcDNA3.1-RACK1 (180-317)-FLAG, and pcDNA3.1-RACK1 (219-317)-FLAG were constructed. The expressions of RACK1 mutants plasmids in HEK 293T cells were detected by Western blot and the localizations in COS7 cells were detected by immunofluorescence technique.ResultsAll the plasmids of RACK1 mutants were successfully constructed. Western blot results indicated that all the mutants in HEK 293T cells expressed effectively except pcDNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG. Immunofluorescence experiments indicated that RACK1 mutants localized both in cytoplasm and nucleus, mainly in cytoplasm.ConclusionRecombinant plasmids of RACK1 mutants are constructed successfully and express effectively in HEK 293T cells and COS7 cells. However there are differences in the expression and localization of the different mutants in COS7 cells, and to contrast with the wild-type RACK1 are also similar. This situation indicates that the expression and cellular localization have some changes happened when there are some domains deficient in the RACK1 protein. The study is very important for exploring the function of the different domains of RACK1.

mutant；recombinant plasmids；fluorescence；Western blot；domain

國家自然科學基金青年基金(編號：81201368)

安徽醫(yī)科大學生命科學學院生物學系，合肥 230032

朱亮亮，男，碩士研究生； 劉曉穎，女，副教授，責任作者，E-mail:liuxiaoying@ahmu.edu.cn； 范禮斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:lfan@ahmu.edu.cn

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.009.html

Q 28；R 392.7

A

1000-1492(2016)11-1595-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.009

2016-07-07接收