大鼠脂肪間充質干細胞體外分離培養及CM-DiI標記后的傳代示蹤

周 虹，郭 杏，李 丹，高小春，熊愛兵，譚美云

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大鼠脂肪間充質干細胞體外分離培養及CM-DiI標記后的傳代示蹤

周 虹1，郭 杏1，李 丹1，高小春1，熊愛兵1，譚美云2

目的 建立大鼠脂肪間充質干細胞(ADSCs)體外分離培養和細胞標記的方法，探討CM-DiI標記ADSCs在體外傳代示蹤的可行性。方法 無菌切取SD大鼠腹股溝脂肪組織，運用酶原消化并差速貼壁的方法獲取原代細胞并進行傳代培養。觀察細胞形態，對第3代ADSCs進行細胞表型鑒定和成骨成脂分化能力鑒定。采用CM-DiI標記第3代ADSCs并進行傳代培養，熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光標記情況，流式細胞儀檢測標記率。結果 ADSCs呈長梭形、漩渦樣生長，傳代后細胞生長增殖速度加快。流式細胞儀檢測結果顯示CD29、CD90陽性表達，CD34、CD45、CD31陰性表達。茜素紅和油紅O染色顯示ADSCs具有成骨成脂分化潛能。CM-DiI標記的紅色熒光存在于細胞膜和細胞質，不存在于細胞核，傳代培養后熒光有所衰減，第3、6、9代的熒光標記率分別為97.09%、66.21%和37.86%。結論 大鼠ADSCs的生長增殖能力強，具有多向分化潛能，采用CM-DiI標記ADSCs簡單易行且示蹤效果良好，可為后期體內實驗提供依據。

脂肪間充質干細胞；細胞培養；CM-DiI；細胞標記

脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在2001年首先由Zuk et al[1]從人脂肪組織中發現，其類似于骨髓間充質干細胞，能夠穩定增殖及自我更新，具有多向分化潛能。與其他干細胞相比，ADSCs具有來源廣泛、取材容易且獲取率高、體外擴增快、細胞老化率低、免疫原性低等優點[2]，其本身也具有血管原性和抗炎活性，能促進組織新生血管形成[3]，這些優點使得ADSCs成為優勢細胞而備受關注。CM-DiI是一種親脂性熒光染料，不溶于水，容易嵌進生物質膜內并作定向擴散運動標記整個胞膜，也能通過活體細胞胞飲作用進入胞質從而標記整個胞質[4]，并且其無細胞毒性，不影響細胞生長和增殖，標記時間長，易于操作，適合標記和示蹤細胞[5]。該研究以CM-DiI標記ADSCs并傳代示蹤，用流式細胞儀檢測傳代后的熒光標記率，為后期進行體內實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養基、胰蛋白酶(美國HyClone 公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；成脂成骨誘導液(廣州賽業公司)；CD29、CD90、CD34、CD45、CD31抗體及大鼠相應的同型對照抗體、流式細胞儀(美國BD公司)；CM-DiI(美國 Molecular Probe 公司，編號c7000)；生物安全柜(西班牙Telstar公司，Telstar Bio ⅡA)；CO2培養箱(美國Thermo 公司)；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 實驗動物 6周齡雄性SPF 級 SD 大鼠 2只，150～180 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.3 實驗方法

1.3.1 ADSCs分離、培養、傳代 用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后將其脫頸處死，在75%酒精中浸泡消毒10 min，無菌切取兩側腹股溝處皮下脂肪組織，放于PBS中反復沖洗3次，盡可能完全剔除血管和筋膜，再用眼科剪將其剪碎至糊狀，裝入無菌的50 ml離心管中，加入2～3倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃恒溫水浴中震蕩消化60 min(期間反復震蕩混勻至少3次)，直至脂肪組織呈乳糜狀，加入等量完全培養基終止消化，70 μm濾網過濾后再加入完全培養基1 500 r/min離心10 min,棄上清液和上層脂肪液，加入PBS吹打混勻后1 000 r/min離心5 min,棄上清液，最后加入完全培養基重懸吹打混勻，以5×105/ml細胞數接種，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后，全量換液。根據細胞生長情況，2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。待細胞達80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 流式細胞儀鑒定ADSCs 將第3代細胞用0.25%胰蛋白酶消化后分裝入10個EP管中，制備100 μl，細胞密度為1×106/ml的單細胞懸液。前5管為陰性對照，加入等量相應的同型對照抗體。其余5管分別加入CD29-APC、CD90-PE-Cy7、CD34-PE、CD45-PerCP、CD31-PE各1 μl，室溫避光孵育15～20 min，400 μl PBS重懸后，上流式細胞儀檢測。

1.3.3 ADSCs的成骨成脂分化潛能 以每孔2×105個細胞的密度將第3代ADSCs接種到6孔板中，待細胞融合度達到80%～90%時分別更換成骨和成脂分化誘導培養基進行誘導培養，更換等量的完全培養基作為陰性對照。成骨誘導3周后采用茜素紅染色觀察細胞的成骨分化效果。成脂分化誘導2周后采用油紅O染色觀察細胞的成脂分化效果。陰性對照組也進行相應染色。

1.3.4 CM-DiI熒光標記ADSCs 取出一支CM-DiI，室溫避光溶解后向管中加入50 μl DMSO混勻，以4 μl CM-DiI與1 ml PBS配成濃度為4 g/L的工作液。將1×106個細胞重懸于1 ml CM-DiI工作液中，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。1 000 r/min離心5 min,將細胞分為3部分，一部分用于流式細胞儀檢測CM-DiI的標記率，另一部分用于熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡照相，最后一部分用于傳代培養。

2 結果

2.1 ADSCs的形態學觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種到培養瓶的原代細胞比較雜，有大量呈圓形的細胞和少數脂滴漂浮，見圖1A。約4 h時，細胞開始貼壁，24 h換液時見部分細胞呈梭形、三角形，但仍有少量脂滴，見圖1B。此后的2～4 d，細胞大部分伸展、體積變大，在4 d再次換液時已可見細胞呈集落或團簇樣生長，呈魚群和旋渦狀，見圖1C。細胞在7～8 d已有80%～90%融合，隨即消化傳代。消化傳代后的細胞生長增殖速度明顯較原代細胞快，細胞逐漸變純，已無脂滴漂浮，見圖1D。到第3代后的細胞越發純化，約不到1 h時即貼壁，生長增殖迅速，形態均一，呈現明顯的魚群和旋渦狀生長，見圖1E。連續傳至11代時，細胞形態無明顯變化，見圖1F。

圖1 倒置相差顯微鏡下大鼠ADSCs形態觀察

A：剛接種的原代細胞形態 ×40；B：接種24 h時的細胞形態 ×100；C：接種4 d時的細胞形態 ×40；D：第1代細胞形態 ×40；E：第3代細胞形態 ×40；F：第11代細胞形態 ×40

2.2 流式細胞儀鑒定細胞表型 第3代ADSCs的表面標志物 CD29、CD90陽性表達，表達率分別為95.04%、99.65%；而 CD34、CD45、CD31陰性表達，表達率分別為0.17%、0.20%、0.14%。見圖2。

2.3 ADSCs的體外誘導成骨成脂分化 成骨誘導3周時，見部分細胞形態較模糊，部分呈橢圓形、多形性，細胞間形成鈣質沉積，茜素紅染色呈陽性，見圖3A；成脂誘導4 d時，可見部分細胞由長梭形變為肥大增寬的多形性細胞，細胞質內開始出現小脂滴，隨著誘導時間延長，脂滴開始增多、變大，2周時可見大多數細胞胞質內出現大小不一的脂滴，油紅O染色呈陽性,見圖3B；對照組染色呈陰性結果，見圖3C、3D。

2.4 ADSCs的CM-DiI體外標記結果 第3代ADSCs標記好后熒光顯微鏡觀察，幾乎全部細胞標記為紅色熒光，見圖4A，貼壁后激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示CM-DiI標記細胞膜和細胞質，不標記細胞核，見圖4B。傳代培養后，熒光有所衰減。傳第6代時，紅色熒光仍較強，但較前減弱，見圖4C；傳第9代時熒光強度明顯減弱，但未消失，見圖4D。

圖2 流式細胞儀鑒定大鼠ADSCs

A:CD29-APC;B:CD90-PE-Cy7;C:CD34-PE;D:CD45-PerCP;E:CD31-PE

圖3 大鼠ADSCs成骨成脂分化

A：成骨實驗組茜素紅染色 ×100；B：成脂實驗組油紅O染色 ×200；C：成骨對照組茜素紅染色 ×100；D：成脂對照組油紅O染色 ×100

第3、6、9代ADSCs的CM-DiI熒光標記率分別為97.09%、66.21%和37.86%，見圖5。

3 討論

研究[6]顯示，ADSCs與骨髓間充質干細胞有著相似的生物學性狀、細胞表型和分化潛能，但其有來源豐富、增殖率高、自體移植不產生排異反應等優點而廣泛應用于再生醫藥和組織工程領域中。本實驗采用酶原消化并差速貼壁的方法分離培養ADSCs，酶的濃度和消化時間是原代細胞提取成功的關鍵因素，實驗中采用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化60 min，多次預實驗證明這是一個比較好的濃度和時間。對于取材部位，近年來先后有文獻[7-8]報道取材于背部、頸部、附睪、腸系膜、腹腔的ADSCs。但在之前的預實驗中發現附睪、腹腔等處的脂肪組織都較少，難以滿足實驗對細胞量的需求，所以本實驗在取材時選取SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織，此處脂肪組織最為豐富，便于盡可能多的分離ADSCs，只要盡可能剔除其中的血管和筋膜，避免過多的雜細胞混入就能提取出較純的ADSCs。在消化脂肪組織的過程中未使用任何裂解液來裂解混雜的紅細胞，因紅細胞有不貼壁的特性，待ADSCs貼壁后便可以通過換液去除，這樣也可以避免裂解液對ADSCs的損傷和影響作用[9]。同時通過換液和消化傳代可以去除漂浮的脂滴和雜細胞，使細胞得以純化。在培養過程中，見ADSCs呈長梭形、多角形、魚群樣、漩渦樣生長，傳代后細胞生長增殖速度快，連續傳至11代細胞形態無明顯變化，證明其生長增殖能力強。

圖4 CM-DiI標記大鼠ADSCs

A：熒光顯微鏡下CM-DiI標記的第3代懸浮狀態的ADSCs ×100；B：激光掃描共聚焦顯微鏡下CM-DiI標記的貼壁狀態的ADSCs×400；C：熒光顯微鏡下CM-DiI標記的第6代貼壁狀態的ADSCs ×100；D：熒光顯微鏡下CM-DiI標記的第9代貼壁狀態的ADSCs ×100

圖5 流式細胞儀檢測第3、6、9代ADSCs的CM-DiI熒光標記率

已有研究[5,10-11]表明，ADSCs能夠表達CD13、CD44、CD29、CD73、CD90、CD59、CD105、CD166、STRO-1等，而不表達CD3、CD4、CD31、CD34、CD45、CD56、CD106等。該研究選取CD29、CD90、CD34、CD45、CD31作為檢測的表面標志物，結果顯示CD29、CD90陽性表達，表達率分別為95.04%、99.65%；CD34、CD45、CD31陰性表達，表達率分別為0.17%、0.20%、0.14%，可以初步證明本實驗分離培養所得細胞為ADSCs，且細胞純度較高。要進一步證實其為ADSCs還必須對其進行分化誘導檢測，該研究對第3代實驗組細胞行成骨成脂誘導分化，在誘導3周時對其進行茜素紅染色，可見鈣結節沉積，在誘導2周時對其行油紅O染色，可見細胞質內有大小不一的脂滴形成，而對照組細胞無上述表現，證明所分離培養細胞具有成骨成脂分化潛能，為ADSCs。

近年來，用于細胞標記示蹤的方法主要有熒光染料標記法(DiI、DAPI、PKH26、Hoechst33342/33258等)、GFP標記法、核酸標記法(同位素標記、5-BrdU標記等)及Y染色體標記法等[12]，都各有其特點。但是上述方法或多或少有操作繁瑣、標記時間短且標記率不高、對細胞有一定毒性等缺點而限制了其應用。而CM-DiI為一種羰花青親脂性熒光染料，其熒光激發波長為553 nm，發射波長為570 nm，能夠與細胞質和細胞膜結合發出強大的紅色熒光，并且對細胞無毒性作用，適于標記和示蹤細胞[13]。我國也有研究者用CM-DiI標記骨髓間充質干細胞、人臍帶間充質干細胞和兔外周血平滑肌祖細胞[14-15]，均證明CM-DiI標記細胞簡單易行、染色速度快、對細胞無毒性，具有良好的應用前景。該研究用CM-DiI標記SD大鼠ADSCs，由于ADSCs為貼壁細胞，標記時可采用以下兩種方法：一是將貼壁細胞消化后離心成細胞沉淀，再直接用CM-DiI工作液重懸，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min；二是將貼壁細胞用PBS清洗2～3遍后，直接用CM-DiI工作液標記，保證染液恰好覆蓋全層細胞即可，先將其置于37 ℃避光孵育20 min，再置于4 ℃避光孵育15 min。該研究采用第一種方法標記第3代SD大鼠ADSCs，熒光顯微鏡下觀察幾乎全部細胞標記為紅色熒光，流式細胞儀測標記率為97.09%，傳代至第6代時熒光仍較強，標記率為66.21%，傳代至第9代時熒光減弱較快，但仍未消失，標記率為37.86%，證明CM-DiI標記后的ADSCs可穩定傳代，維持熒光存在。傳代后標記率減低、熒光強度逐漸減弱的原因可能是：① 實驗過程中細胞換液、傳代未能完全避光；② 細胞增殖分裂導致染料相對減少；③ CM-DiI自發出現熒光泯滅；④ 顯微鏡觀察拍照時間過久導致熒光減少。

綜上所述，運用酶原消化并差速貼壁的方法可獲取純度高、生長增殖能力強和具有多向分化潛能的ADSCs，CM-DiI標記細胞簡單易行，標記率高，具有標記細胞后傳代示蹤的可行性，可作為標記和示蹤SD大鼠脂肪間充質干細胞的良好熒光染料。

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Isolation, culture of rat adipose-derived stem cells and passage tracing after CM-DiI labelinginvitro

Zhou Hong,Guo Xing,Li Dan,et al

(DeptofBurnsandPlasticSurgery,TheAffiliatedHospitalofSouthMedicalUniversity,Luzhou646000)

ObjectiveToestablishamethodforisolation,cultureandcelllabelingofratadipose-derivedstemcells(ADSCs)andinvestigatethepassagetracingfeasibilityofCM-DiIlabeledADSCsin vitro.MethodsAdiposetissuewasharvestedfromtheinguinalfatpadofSprague-Dawleyratsundersterileconditions.Bymeansofcombiningzymogendigestionwithdifferentialvelocityadherence,theprimarycellswereisolated.Theywereusedonserialsubcultivation.Themorphologyofcellswasobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope.ThemolecularphenotypeanddifferentiationpotentialityofthreepassagedADSCswereidentified.ThreepassagedADSCswerelabeledbyCM-DiIandtheywereusedonserialsubcultivation.Fluorescencelabelingofcellswereobservedunderthefluorescenceinvertedmicroscopeandlaserscanningconfocalmicroscope.Thelabelingratewasdetectedbyflowcytometry.ResultsADSCsshowedlongspindleshapeandvortexlikegrowth.Afterpassages,thegrowthandproliferationrateofcellswereaccelerated.ThecellswereidentifiedpositiveforCD29andCD90makers,andtheyshowedthelackofCD34,CD45andCD31expressions.AlizarinredandoilredOstainingshowedADSCscouldbedifferentiatedtoosteoblastsandadipocytes.TheredfluorescenceofCM-DiIlabelingexistedinthecellmembraneandcytoplasm,whichdidnotexistinthecellnucleus.Afterpassages,thefluorescencewasattenuated,andthefluorescencelabelingratesofthethird,sixthandninthpassagewere97.09%, 66.21%and37.86%,respectively.ConclusionRatADSCscangrowandproliferaterapidly,andtheyhavemultipledifferentiationpotential.CM-DiIcanlabelADSCssimplyandeffectively.Thesecanprovidethebasisforthefollowingexperimentin vivo.

adipose-derivedstemcells;cellculture;CM-DiI;celllabeling

國家自然科學基金(編號：31271049)；四川省衛生廳科研課題(編號：090228)；瀘州市科學技術局指導性科技計劃項目 (編號：2010-6)

西南醫科大學附屬醫院1整形燒傷科、2骨關節外科，瀘州 646000

周 虹，女，碩士研究生； 郭 杏，女，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail:gx412@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.008.html

Q 813.1+1

A

1000-1492(2016)11-1590-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.008

2016-06-27接收