人EBI3蛋白及其突變體的表達及定位研究

邢雪梅，耿慧武，潘林鑫，劉澤宇，姚 亮，鄧歡歡，劉曉穎，范禮斌

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人EBI3蛋白及其突變體的表達及定位研究

邢雪梅1，耿慧武1，潘林鑫1，劉澤宇1，姚 亮2，鄧歡歡2，劉曉穎1，范禮斌1

目的 研究人EB病毒誘導的基因3(EBI3)及其突變體在哺乳動物細胞中的表達及定位差異及其原因。方法 基于NCBI數據庫中人EBI3氨基酸的序列分析，利用分子克隆技術構建人EBI3真核表達質粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、單獨包含氨基端或羧基端Ⅲ型纖連蛋白(FN3)結構域的缺失突變體的表達質粒pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG和pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG以及第210位天冬氨酸(Asp)點突變體Asp210的表達質粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG；Western blot方法檢測EBI3及其突變體在HEK 293T細胞中的表達；免疫熒光實驗觀察人EBI3及各突變體在COS7細胞中的定位。結果 成功構建了下游攜帶FLAG標簽的人EBI3及其突變體的真核表達質粒；Western blot結果顯示重組蛋白均能在HEK 293T細胞中穩定表達；經激光共聚焦顯微鏡觀察，EBI3及其缺失突變體在COS7細胞的表達位置發生明顯變化。結論 人EBI3及其突變體真核表達質粒均能在HEK 293T、COS7細胞中成功表達；人EBI3缺失突變體在COS7細胞中的定位發生明顯變化，氨基端結構域可能在EBI3蛋白的正確定位中發揮重要作用；EBI3蛋白的第210位Asp的突變影響了其在細胞內的定位。

EBI3；質粒構建；Western blot；免疫熒光

EB病毒誘導的基因3 (Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)是從EB病毒感染的B淋巴細胞中發現并命名，定位于染色體的19p13.2/3區域，全長1 161 bp，編碼的成熟EBI3蛋白是一種34 ku 的可溶分泌性糖蛋白[1]。人體內，EBI3主要表達于淋巴器官如扁桃體、脾，提示EBI3是重要的免疫因子，參與免疫系統的調節。EBI3蛋白也在胎盤中大量表達，且隨著妊娠時間的延續而增加。EBI3與p19、p28、p35及p40同屬于IL-12家族，與p40在結構上有27%的同源性[2]。EBI3可分別與p28、p35結合，形成細胞因子IL-27(p28/EBI3)和IL-35(p35/EBI3)[3-4]。氨基酸序列分析顯示，EBI3蛋白包括兩個串聯的經過修飾的Ⅲ型纖連蛋白結構域FN3，該結構域通常包含兩對半胱氨酸殘基形成的二硫鍵，以及一個典型的Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)的基序[5-6]。該研究通過運用分子克隆技術，結合蛋白數據庫中已知人EBI3蛋白的信息，構建了單獨包含氨基端或羧基端FN3結構域的EBI3的缺失突變體，分別轉染入真核細胞HEK 293T和COS7細胞，對突變體的表達及定位進行比較。針對IL-27結構的研究[6]表明，EBI3蛋白的第210位的天冬氨酸Asp參與形成帶負電荷的蛋白質表面結構，是影響EBI3與IL-27p28的對應正電荷區域結合的關鍵殘基。設想Asp210可能也參與EBI3與其他蛋白的結合，因此構建了EBI3Asp210點突變體的真核重組質粒，了解其表達和定位的改變。該研究旨在通過探討結構域及關鍵氨基酸殘基的改變對EBI3蛋白在真核細胞中的蛋白表達及細胞定位的影響，進一步揭示EBI3蛋白在人類免疫系統中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、細胞株、質粒和引物 真核表達載體pcDNA3.1(+)、E.coliDH5α感受態細菌、COS7及HEK 293T細胞株、含人EBI3全長cDNA序列的質粒均為本生物實驗室保存；實驗使用引物由上海生工生物有限公司合成。

1.1.2 主要工具酶和試劑 Pfu PCR MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)；PrimeSTAR Max DNA Polymerase(日本TaKaRa公司)；T4 DNA Ligase、DNA限制性內切酶(加拿大Fermentas公司)；DNA膠回收試劑盒(美國Axygen公司)；質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國CLARK公司)； LipofectamineTM2000、Opti-MEM Reduced Serum Medium(美國Invitrogen公司)；Western blot相關試劑(上海碧云天生物技術研究所)； Monoclonal anti-FLAG M2(美國Sigma公司)；TRITC/FITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；PVDF膜(加拿大BioBasic公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國Pierce公司)。

1.1.3 主要儀器 紫外-可見分光光度計(美國Nano-Drop公司)；Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；超聲破碎儀(VC750型，美國Sonic公司)；電泳儀(BIO RAD 041BR型，美國Bio-Rad公司)；垂直電泳槽和轉移電泳槽(北京六一儀器廠)；Bioshine ChemiQ化學發光成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EBI3突變體設計 分析美國國立生物技術信息中心NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中人EBI3序列的結構域信息，EBI3蛋白的氨基酸結構包括兩個串聯的保守性區域，即經過修飾的纖連蛋白Ⅲ型結構域FN3，分別包含第47～115、129～224位氨基酸。本實驗設計構建了EBI3野生型以及分別包含氨基端、羧基端FN3結構域的三種突變體,同時構建了將EBI3第210位天冬氨酸突變為丙氨酸的Asp210點突變體，見圖1。

圖1 EBI3蛋白結構及突變體質粒構建示意圖(紅線為210位天冬氨酸突變為丙氨酸)

1.2.2 野生型人EBI3及缺失突變體構建 運用軟件Primer Premier 5設計出下游帶FLAG標簽的EBI3全長及其突變體的引物(表1，下劃線部分為FLAG標簽序列)，設計的特定基因目的片段均構建于真核表達載體pcDNA3.1(+)上，特異性引物均由上海生工生物工程有限公司合成。以含人EBI3全長cDNA序列的質粒為模板，采用25 μl PCR體系，使用廠商推薦的PCR反應程序，分別用Pfu MasterMix擴增出EBI3-FLAG、用PrimeSTAR Max 擴增出EBI3(1～135)-FLAG和EBI3(125～230)-FLAG目的片段，DNA膠回收試劑盒回收PCR產物。分別將真核表達載體pcDNA3.1(+)和回收的PCR產物雙酶切后進行凝膠電泳，并用DNA膠回收試劑盒再次回收,將回收產物用T4 DNA連接酶于16 ℃連接16 h,連接產物轉化入DH5α感受態細菌，37 ℃培養箱內倒置培養約16 h，挑取單克隆在含有氨芐青抗性的LB培養基中，37 ℃恒溫震蕩培養約12 h；堿裂解法提取質粒后做雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的質粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 點突變體構建 構建了點突變體Asp210的真核表達重組質粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAGEBI3，引物設計見表1。配制突變PCR反應液體系，在1.5 ml離心管中加PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，測序正確的pcDNA3.1-EBI3-FLAG質粒模板30 ng，加雙蒸水至25 μl。反應條件：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，共32個循環，72 ℃ 10 min，PCR反應結束后產物4 ℃保存，先取5 μl PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小正確后，再將裝有余下PCR產物的離心管迅速放入冰浴5 min，之后加入2 μl DpnⅠ酶，37 ℃水浴2 h消化模板，隨后將離心管內溶液全部轉化入DH5α感受態細菌中進行培養，提取質粒，酶切鑒定正確的克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 細胞培養 將HEK 293T細胞和COS7細胞以適當濃度分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養液(含青霉素和鏈霉素各100 U/ml)中，于37℃、5% CO2細胞培養箱培養，待細胞融合至80%～90%時進行傳代。

表1 質粒名稱及引物序列

1.2.5 Western blot檢測EBI3野生型和突變體的蛋白表達 轉染前約24 h，傳代HEK 293T細胞，以1×105～2×105/cm2的密度均勻接種于35 mm的培養皿中，待細胞長至80%～90%匯合度時，進行轉染實驗，重組質粒與LipofectamineTM2000的比例為1 μg ∶2 μl。轉染后48 h分別收集細胞，用預冷的PBS清洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的細胞裂解液，4 ℃混旋裂解1 h，14 000 r/min離心20 min收集上清液，經蛋白定量后制成樣品進行SDS-PAGE電泳；100 V電轉膜1 h；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉PVDF膜2 h，FLAG-M2抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗；二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗后顯影。

1.2.6 免疫熒光實驗 轉染前約24 h，將滅菌過的蓋玻片置于35 mm的培養皿，用多聚賴氨酸溶液包被后自然晾干。傳代COS7細胞，以1×105～2×105/cm2的密度將細胞均勻接種于預置蓋玻片的培養皿，37 ℃、5% CO2繼續培養，待細胞長至50%～60%匯合度時，進行轉染實驗。分別轉染EBI3野生型及其突變體質粒，重組質粒與LipofectamineTM2000的比例為1 μg ∶1 μl。培養6 h后換含有10%血清的培養液繼續培養約24 h。取出蓋玻片，預冷的PBS清洗后依次用預冷的甲醇(-20 ℃冷藏)和乙醇(室溫)固定細胞，預冷的PBS清洗后用含1%脫脂奶粉的TBST室溫封閉0.5 h,PBS清洗后Monoclonal anti-FLAG M2(1 ∶200)室溫孵育2 h，TRITC/FITC標記山羊抗小鼠IgG(1 ∶200)室溫孵育1 h，PBS清洗后0.5 μg/ml 的DAPI溶液染核，PBS清洗后封片，4 ℃儲存。

2 結果

2.1 EBI3缺失突變體的構建與鑒定 應用堿裂解法抽提重組質粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG、pcDNA3.1-EBI3(125～230)-FLAG，經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后置紫外凝膠分析儀下觀察，在相應位置出現目的條帶，酶切正確的克隆送測序，結果證實目的片段正確插入到pcDNA3.1(+)載體中。見圖2。

2.2 EBI3點突變體的鑒定 點突變PCR反應結束后，取5 μl經凝膠電泳鑒定，確認PCR產物片段符合pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的大小，結果見圖3A。同樣使用堿裂解法抽提EBI3點突變體質粒，經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定正確，見圖3B。送重組質粒至上海生工生物工程有限公司測序，結果運用BLAST 軟件比對點突變測序序列，確認點突變重組質粒序列正確，見圖3C。

圖2 重組質粒酶切鑒定圖

M1：λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Marker；M2：TaKaRa DL2000 Marker；1：pcDNA3.1-EBI3-FLAG酶切鑒定結果；2：pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG酶切鑒定結果；3：pcDNA3.1- EBI3(125～230)-FLAG酶切鑒定結果

圖3 pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG重組質粒的鑒定

A: pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG PCR產物凝膠電泳圖，M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG PCR產物；B：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG酶切鑒定圖，M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；2：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG 酶切鑒定結果；C：pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG與野生型的EBI3序列比對圖

圖4 Western blot檢測EBI3及缺失突變體在HEK 293T細胞中的表達

1：轉染pcDNA3.1-EBI3-FLAG的細胞裂解液；2：轉染pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG的細胞裂解液；3：轉染pcDNA3.1-EBI3(1～135)-FLAG的細胞裂解液；4：轉染pcDNA3.1-EBI3(125～230) -FLAG的細胞裂解液

2.3 EBI3及其突變體在HEK 293T細胞中的表達 轉染48 h后，收集細胞，Western blot檢測到HEK 293T細胞裂解液中野生型和突變體蛋白，其分子量與預期分子量一致，即EBI3-FLAG、EBI3-D210A-FLAG的分子量均為33 ku，EBI3(1～135)-FLAG、EBI3(125～230)-FLAG的分子量分別為15 ku 和12 ku。見圖4。

2.4 EBI3及其突變體在COS7細胞中的定位 轉染24 h后經激光共聚焦顯微鏡觀察：野生型EBI3在胞質中大量表達且存在斑塊狀分布，細胞核中有極少量表達；缺失突變體EBI3(1～135)-FLAG在胞質中表達大幅減少，在核膜處和細胞核內表達增多；EBI3(125～230) -FLAG表達主要集中于核膜和核內，細胞質中少量表達；Asp210點突變體的表達蛋白EBI3-D210A-FLAG在胞質、核膜與核內均有表達。見圖5。

3 討論

固有免疫系統是機體防止外來病原體侵襲的天然防線，EBI3蛋白通過構成不同的細胞因子，在機體免疫系統中發揮著免疫防御和免疫調節的作用。一方面可以誘導產生IFNγ，促進Th1細胞的分化和增殖；另一方面通過抑制T細胞增殖等防止過度的炎癥反應的發生[7-8]。機體中的EBI3蛋白與IL-12、IL-23共同由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞以及B細胞等合成，通過病原體特異性抗體識別模式被激活而快速發揮非特異性抗感染等作用[9-11]，另外作為IL-35的重要亞基，EBI3也可以由Foxp3+調節性T細胞分泌，亦發現在外周γδT細胞、CD8+T細胞和胎盤滋養層細胞中，EBI3可與p35共同表達[8,12]。在機體中，EBI3的分泌量遠大于其參與構成IL-27、IL-35的需要量，因而Collison et al[7]認為多分泌的EBI3可能以單體或者同二聚體的形式拮抗IL-27或IL-35的作用。機體中EBI3表達的異常與多種疾病的發病機制密切相關，如炎癥性腸炎克羅恩病、嚴重的腫瘤性疾病霍奇金病、鼻咽癌等, 在宮頸癌組織中亦發現EBI3表達量顯著提高[13-14]。

圖5 EBI3及其突變體在COS7細胞中的表達及定位 ×1 500

本研究成功構建了野生型EBI3及分別包含氨基端、羧基端結構域的缺失突變體的真核表達質粒，并且構建了將210位天冬氨酸突變為丙氨酸的定點突變真核表達質粒，轉染至真核細胞HEK 293T、COS7細胞系中均能成功表達。免疫熒光定位顯示野生型EBI3主要在COS7細胞胞質中呈斑塊狀分布，且位于胞核的一側，疑似分布在內質網上，Devergne et al[1]也認為EBI3蛋白分子傾向于以非成熟的形式與分子伴侶calnexin結合積聚于內質網上，但仍需進一步通過對內質網進行熒光標記加以確認。EBI3(1～135)-FLAG融合蛋白中包含了氨基端及一個FN3結構域，與野生型相比，EBI3(1～135)-FLAG在細胞質中的分布減少，但在胞質內仍可見斑塊狀集中分布，EBI3(125～230)-FLAG融合蛋白中包含了另一個位于羧基端的FN3結構域，該突變體蛋白分子較集中分布在核膜，在細胞質中表達量極低。比較免疫熒光的定位差異，可以推測EBI3蛋白分子中的氨基端存在重要的結構幫助其定位于細胞質，該結構對于EBI3蛋白的分泌亦發揮重要作用；EBI3蛋白分子中的兩個FN3結構域則可能參與了EBI3蛋白與其他蛋白分子的結合過程。Asp210突變體的表達蛋白EBI3-D210A-FLAG在細胞質內形成的斑塊較為均勻，其在核膜處的分布也較集中,推測EBI3蛋白的第210位的Asp既是影響該蛋白分子與p28結合的關鍵殘基，也可能影響其在細胞內定位。

本課題組在前期的酵母雙雜交文庫篩選工作中發現EBI3蛋白可與多個蛋白相互作用，但是作用的具體結構位置尚不明確。本實驗通過研究含有EBI3不同結構域突變體及Asp210點突變體的蛋白表達和定位差異，為后續進一步揭示EBI3蛋白的功能提供重要的細胞學基礎。

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Expression and localization of human protein EBI3 and its mutants

Xing Xuemei, Geng Huiwu, Pan Linxin, et al

(DeptofBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

ObjectiveToanalyzeexpressionandthereasonofdifferentlocalizationamongwild-typeEBI3(epstein-barrvirus-inducedgene3)anditsmutantsinmammaliancelllines.MethodsBasedontheanalysisofaminoacidsequencefromNCBIdatabase,thehumanEBI3eukaryoticexpressionplasmidspcDNA3.1-EBI3-FLAGwasconstructed,itsmutantspcDNA3.1-EBI3(1-135)-FLAGandpcDNA3.1-EBI3(125-230)-FLAGwhichcontainedsingleFN3domaininaminoterminalorcarboxyterminalandEBI3Asp210pointmutantpcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAGwerealsoconstructed;WesternblotanalysiswasappliedtodetecttheexpressionoftherecombinanteukaryoticexpressionplasmidsinmammalianHEK293TcellsandimmunofluorescencetechniquewasusedtodetectthecellularlocalizationinCOS7celllines.ResultsTherecombinanteukaryoticexpressionplasmidswithdownstreamedFLAG-tagofhumanwild-typeEBI3anditsmutantsweresuccessfullyconstructed;WesternblotshowedthattherecombinantproteinscouldstablyexpressinHEK293Tcells;confocalfluorescencemicroscopyresultsindicatedthesignificantchangesinlocalizationofthemutantsofEBI3.ConclusionTheeukaryoticexpressionplasmidsofhumanwild-typeEBI3anditsmutantscansuccessfullyexpressinHEK293TandCOS7cells.ThelocalizationofitsdeletionmutantsinCOS7cellschangesignificantly,indicatingdomainstructureinaminoterminalmayplayanimportantroleinEBI3proteincorrectlocation;theAsp210ofEBI3alsoaffectsthelocalizationofEBI3withinthecell.

EBI3;plasmidconstruction;Westernblot;immunofluorescence

國家自然科學基金青年基金(編號: 81201368)

安徽醫科大學生命科學學院1生物學系、2生物科學，合肥 230032

邢雪梅，女，碩士研究生； 劉曉穎，女，副教授，責任作者，E-mail:liuxiaoying@ahmu.edu.cn； 范禮斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:lfan@ahmu.edu.cn

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.005.html

Q 28；R 392.6

A

1000-1492(2016)11-1573-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.005

2016-07-07接收