線粒體未折疊蛋白反應(yīng)在Sir2抑制帕金森轉(zhuǎn)基因果蠅中的作用

戚欣欣，肖志超，范曉麗，孫 莉，李清華

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線粒體未折疊蛋白反應(yīng)在Sir2抑制帕金森轉(zhuǎn)基因果蠅中的作用

戚欣欣1，肖志超2，范曉麗1，孫 莉1，李清華3

目的 探討Sir2對帕金森病(PD)轉(zhuǎn)基因果蠅是否有神經(jīng)保護作用及與線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(UPRmt)的相關(guān)性。方法 選用Mhc-GAL4啟動子，利用經(jīng)典的GAL4-UAS系統(tǒng)構(gòu)建Mhc-GAL4/UAS系統(tǒng)Pink1B9PD轉(zhuǎn)基因果蠅模型，通過遺傳干預(yù)使Sir2在Mhc-GAL4/UAS系統(tǒng)PD轉(zhuǎn)基因果蠅運動神經(jīng)元內(nèi)過表達，觀察Sir2過表達對果蠅運動神經(jīng)元變性是否具有神經(jīng)保護作用，然后通過RNAi技術(shù)抑制UPRmt相關(guān)基因熱休克蛋白60(Hsp60)、GCN-2的表達，觀察Sir2過表達對抑制果蠅運動神經(jīng)元變性的作用，以及驗證這種作用是否與UPRmt相關(guān)。結(jié)果 Sir2過表達明顯抑制了PD轉(zhuǎn)基因果蠅運動神經(jīng)元變性，顯著改善了果蠅運動能力，而在UPRmt被抑制后，Sir2的保護作用明顯減弱。結(jié)論 Sir2對PD轉(zhuǎn)基因果蠅具有神經(jīng)保護作用，而這種神經(jīng)保護作用與UPRmt相關(guān)。

帕金森病；Sir2；轉(zhuǎn)基因果蠅；線粒體未折疊蛋白反應(yīng)

帕金森病又稱特發(fā)性帕金森病(idiopathic Parkinson′s disease，PD)，簡稱PD，也稱為震顫麻痹，是第二大常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，臨床表現(xiàn)為面具臉、靜止性震顫、行動遲緩、隨意運動缺失、肌張力增高、關(guān)節(jié)僵硬等一系列癥狀[1]。研究[2]指出PINK1的缺失能夠?qū)е戮€粒體形態(tài)功能異常。而近幾十年的研究[3]表明，線粒體的功能紊亂是PD發(fā)病的一個重要原因。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)是一類從古細菌到人類進化都高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依賴的組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)[4]，是sirtuin蛋白家族的一員，在DNA損傷修復(fù)、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、能量代謝、線粒體功能保護等方面起著重要作用[5-7]。最近的研究[8]表明，Sir2可增加線粒體編碼的MTCO1(線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物IV亞單位)和核編碼的ATP5A(線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物IV亞單位)之間的比率，破壞線粒體核蛋白失衡，誘導(dǎo)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response，UPRmt) ，改善線粒體功能并顯著延長了線蟲的壽命。由此，該研究利用已建立的PD轉(zhuǎn)基因果蠅模型，探討Sir2是否能夠保護PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性，以及抑制UPRmt后Sir2還能否抑制PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性，進一步研究UPRmt在Sir2神經(jīng)保護的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 果蠅品系：野生型基因w1118、Mhc-GAL4、Sir2、Hsp60 RNAi、GCN-2 RNAi購自美國Bloomington果蠅種系中心。UAS-PINK1B9及雙平衡系果蠅sco/CyO；TM3/TM6由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 果蠅雜交

1.2.1.1 構(gòu)建w1118/+;Mhc-GAL4/+的果蠅 將w1118的處女蠅與Mhc-GAL4的雄果蠅雜交，收取F1代雄果蠅，即基因型為w1118/+;Mhc-GAIA/+的目的果蠅，此為PD轉(zhuǎn)基因果蠅的正常對照組果蠅(control)。

1.2.1.2 構(gòu)建PINK1B9/y;Mhc-GAL4/+的果蠅 將PINK1B9/FM6;Mhc-GAL4的處女蠅與w1118的雄果蠅雜交,收取F1代雄果蠅,即基因型為PINK1B9/y；MHC-GAL4/+，即為PD轉(zhuǎn)基因疾病組果蠅(PD flies)。

1.2.1.3 構(gòu)建PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4/+的果蠅 將PINK1B9/FM6;Mhc-GAL4/+的處女蠅與Sir2的雄果蠅雜交,收取F1代雄果蠅,即基因型為PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4/+，此為Sir2過表達干預(yù)PD轉(zhuǎn)基因果蠅[Sir2(+)PD flies]。

1.2.1.4 構(gòu)建PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,Hsp60 RNAi的果蠅 將Sir2處女蠅與雙平衡系果蠅sco/CyO;TM3/TM6雄果蠅雜交構(gòu)建Sir2/ sco;TM3/+的平衡果蠅；同時Hsp60 RNAi的處女蠅與雙平衡系果蠅sco/CyO；TM3/TM6雄果蠅雜交，構(gòu)建+/CyO;Hsp60 RNAi/TM6的平衡果蠅。然后將Sir2/ sco;TM3/+處女蠅與+/CyO;Hsp60 RNAi/TM6雄果蠅雜交，得到Sir2/CyO;Hsp60 RNAi/TM3的雙平衡系果蠅，再將此雄果蠅與PINK1B9/FM6;Mhc-GAL4/+處女蠅雜交，收取F1代不帶卷翅且不帶短剛毛的雄性目的果蠅，即基因型PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,Hsp60 RNAi，此為抑制UPRmt干預(yù)組1，敲除分子伴侶Hsp60而Sir2過表達的PD轉(zhuǎn)基因果蠅[Sir2(+)PD flies Hsp60(-)]。

1.2.1.5 構(gòu)建PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,GCN-2 RNAi的果蠅 將GCN-2 RNAi的處女蠅與雙平衡系果蠅sco/CyO;TM3/TM6雄果蠅雜交，構(gòu)建+/CyO;GCN-2RNAi/TM6的平衡果蠅。然后將已構(gòu)建好的Sir2/sco;TM3/+處女蠅與+/CyO;GCN-2 RNAi/TM6雄果蠅雜交，得到Sir2/CyO;GCN-2 RNA i/TM3的雙平衡系果蠅，再將此雄果蠅與PINK1B9/FM6;Mhc-GAL4/+處女蠅雜交，收取F1代不帶卷翅且不帶短剛毛的雄性目的果蠅，即基因型PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,GCN-2 RNAi，此為抑制UPRmt干預(yù)組2，GCN-2基因敲除而Sir2過表達的果蠅[Sir2(+)PD flies GCN-2(-)]。

1.2.2 數(shù)據(jù)采集

1.2.2.1 果蠅形態(tài)學(xué)檢測 觀察五組果蠅體態(tài)：基因型w1118/+;Mhc-GAL4/+的果蠅為對照組(control)；基因型PINK1B9/y;Mhc-GAL4/+的果蠅為PD疾病模型組(PD flies);基因型PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4/+的果蠅為Sir2(+)PD flies；基因型PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,Hsp60 RNAi果蠅為Sir2(+)PD flies Hsp60(-)；基因型PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4,GCN-2 RNAi的果蠅為Sir2(+)PD flies GCN-2(-)。

1.2.2.2 果蠅飛行試驗 觀察分組同1.2.2.1果蠅的翅膀異常率、飛行率。將5 d的各組果蠅隨機挑選100只雄性果蠅，CO2麻醉后，每5只裝入1個空的果蠅培養(yǎng)管中，半小時果蠅完全復(fù)蘇后，觀察果蠅翅膀異常率，輕輕敲打培養(yǎng)管壁計算果蠅飛起數(shù)。在同樣的恒溫恒濕及相同觀察時間，重復(fù)至少3次實驗。

1.2.2.3 果蠅線粒體三磷酸腺苷(ATP)濃度檢測 分別取control、PD flies、Sir2(+)PD flies三組第5天的雄性果蠅各50只，切取果蠅胸部組織，分別放入液氮研磨，并加入200 μl HClO4繼續(xù)研磨，研磨后3 500 r/min離心15 min，取上清液，緩慢加入0.2 mol/L KOH，調(diào)節(jié)pH至7.5，再3 500 r/min離心15 min后取上清液至新EP管，得到樣品。采用高效液相色譜儀(HPLC)檢測制備成功的樣品中ATP含量。以上實驗至少重復(fù)3次。

1.2.2.4 果蠅mRNA水平檢測 果蠅分組同1.2.2.1，切取5 d的雄性果蠅胸部各40只，分別提取各組的總RNA，使用TaKaRa Code No.RR047A試劑盒對提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到各組果蠅的cDNA，再以cDNA為模板，應(yīng)用7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)儀器進行qRT-PCR，檢測mRNA表達水平。應(yīng)用primer 5.0軟件設(shè)計合成引物，合成18S、Sir2、Hsp60、Hsc70-5、Hsp10、Clpx的各引物序列(美國Invitrogen有限公司)。見表1。

表1 引物序列

1.2.2.5 Western blot檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氧酶鐵-硫蛋白3(NDUFS3)、Hsp60、p-eIF2α等蛋白的表達 果蠅分組同1.2.2.1，切取5 d的雄性果蠅胸部，各稱重10 mg，按比例加入RIPA裂解液提取各組總蛋白，與5×loading buffer混合后上樣，經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠(10%分離膠+5%濃縮膠)電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌，一抗孵育4 ℃過夜，回收抗體，TBST洗滌后，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，與免疫印跡發(fā)光試劑進行反應(yīng)，暗室壓膠片顯影、定影。

圖1 果蠅形態(tài)學(xué)觀察

A：Control(基因型為w1118/+;Mhc-GAL4/+，果蠅翅膀重合率較好)；B：PD files(基因型為PINK1B9/y;Mhc-GAL4/+，果蠅翅膀分叉異常)；C：Sir2(+) PD files(基因型為PINK1B9/y;Sir2/+;Mhc-GAL4/+，改善了PD轉(zhuǎn)基因果蠅表型)

2 結(jié)果

2.1 Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性作用 在Mhc-GAL4肌肉啟動子啟動下，利用果蠅GAI4-UAS系統(tǒng)將靶基因特異性地在肌肉組織中表達，表現(xiàn)在翅膀異翅率與飛行能力的變化。與control比較，PD轉(zhuǎn)基因果蠅的翅膀有明顯翅膀分叉、下垂、甚至豎立不閉合的異常表現(xiàn)，并且飛行能力明顯減弱，見圖1。Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅干預(yù)后，翅膀異翅率明顯得到改善，飛行能力提高，見圖1、2。檢測3組果蠅Sir2的mRNA水平，Sir2過表達干預(yù)組Sir2(+) PD flies較control、PD flies表達水平均較高，見圖3。檢測ATP水平，結(jié)果顯示PD轉(zhuǎn)基因果蠅組ATP水平明顯較Sir2(+)PD flies及control低，見圖4。Western blot檢測通過條帶灰度分析檢測NDUFS3蛋白水平表達量(將β-actin蛋白表達水平設(shè)置成內(nèi)參進行校準比較)，Sir2(+)PD flies中NDUFS3蛋白的表達量增高，挽救了線粒體Complex I，見圖5。

2.2 抑制UPRmt后Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性作用 敲除PD轉(zhuǎn)基因果蠅神經(jīng)元內(nèi)UPRmt的標志物Hsp60、GCN-2基因，抑制UPRmt而Sir2過表達，對PD轉(zhuǎn)基因果蠅進行干預(yù)，翅膀異常較Sir2(+)PD flies低，異常表現(xiàn)顯著，飛行能力也較弱，抑制UPRmt而Sir2過表達干預(yù)并未挽救PD轉(zhuǎn)基因果蠅，見圖6。

2.3 Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅神經(jīng)元UPRmt的誘導(dǎo)作用 檢測control、PD flies及三個干預(yù)組果蠅Hsp60及其他分子伴侶的mRNA水平，Sir2(+)PD flies干預(yù)后誘導(dǎo)UPRmt相關(guān)分子伴侶mRNA表達水平升高，阻斷UPRmt的干預(yù)組較低，見圖7。Western blot檢測，通過條帶灰度分析檢測Hsp60、Total eIF2α、eIF2α磷酸化蛋白水平表達量(將β-actin蛋白表達水平設(shè)置成內(nèi)參進行校準比較，所有結(jié)果重復(fù)3次)，Hsp60表達水平Sir2(+)PD flies較control、PD flies及其它兩組干預(yù)組都高，與qRT-PCR Hsp60 mRNA水平表達一致；Total eIF2α表達水平相似，eIF2α磷酸化蛋白表達水平PD flies較control升高，低于Sir2(+)PD flies，抑制UPRmt干預(yù)組2的eIF2α磷酸化蛋白表達水平最低，見圖8。

3 討論

PD是僅次于AD的第二大神經(jīng)退行性疾病[1]，也是中老年人最常見的錐體外系疾病，65歲以上老人發(fā)病率約為1 000/10萬，隨年齡而增高，通常從發(fā)病至診斷平均為2.5年。主要病理標志為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元缺失，剩余存活的神經(jīng)元a-突觸核蛋白(a-synuclein，a-syn)和胞質(zhì)內(nèi)包涵體(lewy body，LB)形成，黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺釋放減少。目前已經(jīng)鑒定了18個與PD相關(guān)的致病基因，如parkin、PINK1、DJ-1、LRRK2、HtrA2、ATP13A2，其中PINKI(phosphatase and tensin-homolog-(PTEN-)induced kinase J，PINK1)的突變與常染色體隱性遺傳的PD有關(guān)。其發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜[2]，PD并非單一因素致病，可能多種因素參與，如年齡老化、環(huán)境因素、遺傳因素、氧化應(yīng)激和自由基生成、免疫學(xué)異常、線粒體功能缺陷等[3]。線粒體是細胞內(nèi)生成ATP主要的能量場所[9],也是各種細胞應(yīng)激損傷最為敏感的細胞器[10-11]。線粒體損傷所產(chǎn)生的氧自由基累積被認為導(dǎo)致了PD等許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[12-13]。最近有關(guān)線蟲的研究[14]表明，激活UPRmt，線粒體應(yīng)激并未導(dǎo)致線粒體功能障礙，反而增加了ATP生成，延長了線蟲壽命。

圖2 果蠅飛行結(jié)果

1：Control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；A：果蠅翅膀異常率；B：果蠅飛行率；與control比較：***P<0.001

圖3 qRT-PCR檢測Sir2 mRNA表達水平

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；與control比較：***P<0.001

圖4 Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅模型的線粒體功能的影響

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；與control比較：***P<0.001

圖5 Western blot檢測Complex I的組分NDUFS3蛋白的表達量

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；與control比較：***P<0.001

圖6 阻斷UPRmt對Sir2過表達抑制PD轉(zhuǎn)基因果蠅作用的影響

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；4：抑制UPRmt干預(yù)組1；5：抑制UPRmt干預(yù)組2；A：果蠅翅膀異常率；B：果蠅飛行率；與control比較：***P<0.001

圖7 qRT-PCR檢測UPRmt相關(guān)線粒體分子伴侶mRNA表達水平

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；4：抑制UPRmt干預(yù)組1；5：抑制UPRmt干預(yù)組2；與control比較：**P<0.01，***P<0.001

圖8 Western blot檢測神經(jīng)元內(nèi)eIF2α磷酸化及Hsp60蛋白表達水平

1：control；2：PD flies；3：Sir2(+) PD flies；4：抑制UPRmt干預(yù)組1；5：抑制UPRmt干預(yù)組2；與control比較：***P<0.001

UPRmt是近年來發(fā)現(xiàn)的一種線粒體應(yīng)激保護機制，當(dāng)線粒體遭遇某些應(yīng)激而致功能紊亂時，打破了線粒體核蛋白平衡，誘導(dǎo)更多線粒體分子伴侶如Hsp60、Hsp10、Hsc70-5的表達，進而更好地促進蛋白正確折疊或降解[15]，并促進GCN-2對真核細胞翻譯起始因子eIF2α的磷酸化，抑制了除線粒體應(yīng)激反應(yīng)外的其它蛋白合成，減少了蛋白向線粒體的輸入，降低線粒體分子伴侶的負荷[9]。

Sir2是依賴的NAD+去乙酰化酶，在線粒體功能保護中具有十分顯著的作用。Sir2能夠打破線蟲線粒體核蛋白平衡，誘導(dǎo)UPRmt[8]。本實驗選用Mhc-GAL4啟動子，利用經(jīng)典的GAL4-UAS系統(tǒng)，構(gòu)建Mhc-GAL4/UAS系統(tǒng)Pink1B9PD轉(zhuǎn)基因果蠅模型，通過遺傳干預(yù)使Sir2在Mhc-GAL4/UAS系統(tǒng)PD轉(zhuǎn)基因果蠅運動神經(jīng)元內(nèi)過表達，Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅同樣具有神經(jīng)保護作用，挽救了PINK1B9PD轉(zhuǎn)基因果蠅模型表型，抑制PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性，提高了果蠅運動能力，使飛行得到改善，以及提高其線粒體的功能，增加了ATP的生成。

Western blot檢測結(jié)果顯示線粒體氧化呼吸鏈中Complex I的組分NDUFS3蛋白的表達量也明顯升高。本研究探討Sir2過表達對PD轉(zhuǎn)基因果蠅的作用是否通過誘導(dǎo)UPRmt而增加線粒體的應(yīng)激適應(yīng)性，從而提高了線粒體功能而具有的神經(jīng)保護作用。敲除與UPRmt相關(guān)的基因分子伴侶Hsp60及與eIF2α磷酸化有關(guān)的GCN-2的基因后，Sir2過表達并未挽救PD轉(zhuǎn)基因果蠅PINK1B9的神經(jīng)毒性，其翅膀分叉豎立較多殘翅較明顯，飛行率較低。qRT-PCR檢測5組果蠅的分子伴侶mRNA的表達量，PD轉(zhuǎn)基因果蠅的Hsp60相關(guān)分子伴侶mRNA水平較control升高，線粒體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，而Sir2過表達干預(yù)后其mRNA表達水平較其它各組均較高，提示Sir2過表達誘導(dǎo)UPRmt提高了果蠅線粒體的應(yīng)激適應(yīng)性從而改善線粒體功能。在果蠅轉(zhuǎn)錄水平Sir2過表達干預(yù)組分子伴侶表達量較高，同樣Western blot檢測Hsp60蛋白表達量也是升高的，以及提高了真核細胞翻譯起始因子eIF2α的磷酸化水平，明確UPRmt在Sir2過表達抑制PD轉(zhuǎn)基因果蠅神經(jīng)變性中的作用。PD等許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制并非單一因素，目前其發(fā)病機制并不明確，臨床上并無有效的藥物進行治療，線粒體的損傷及功能障礙與PD密切相關(guān)，Sir2通過誘導(dǎo)UPRmt提高線粒體應(yīng)激適應(yīng)性抑制PD轉(zhuǎn)基因果蠅的神經(jīng)變性，為臨床探索利用UPRmt誘導(dǎo)藥物治療PD疾病提供理論依據(jù)。

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Role of mitochondrial unfolded protein response in Sir2 suppresses the neurodegeneration of PD transgenic Drosophila

Qi Xinxin1,Xiao Zhichao2,Fan Xiaoli1,et al

(1BasicMedicalCollege,GuilinMedicalUniversity,Guilin541000；2DeptofCardiothoracicSurgery，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000)

ObjectiveTo investigate whether Sir2 has a neuroprotective effect on PD transgenic Drosophila and the relevance of UPRmt.MethodsThe Mhc-GAL4 promoter and the classical GAL4-UAS system were used to construct PD transgenic Drosophila models-Pink1B9 which could be expressed in Drosophila muscles. To investigate whether Sir2 overexpression in PD transgenic Drosophila of the Mhc-GAL4/UAS system by genetic intervention had neuroprotective effects on neurodegeneration. The chaperone Hsp60 and GCN-2 expression associated with UPRmtby RNA interference were inhibited to observe the role of Sir2 overexpression in suppressing neurodegeneration in PD transgenic Drosophila and verify the correlation with UPRmt.ResultsSir2 overexpression significantly inhibited neurodegeneration in PD transgenic Drosophila and improved the athletic ability. The effect of Sir2 was weakened by inhibiting UPRmt.ConclusionSir2 overexpression has neuroprotective effects on PD transgenic Drosophila which is associated with UPRmt.

PD;Sir2;transgenic Drosophila;UPRmt

國家自然科學(xué)基金(編號：81160163、81460180)

1桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541000 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2心胸外科、3神經(jīng)內(nèi)科，桂林 541000

戚欣欣，女，碩士研究生； 孫 莉，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：635109710@qq.com； 李清華，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：qhli1999@163.com.cn

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.002.html

R 74；R 394

A

1000-1492(2016)11-1559-07

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.002

2016-06-22接收