肺結核患者髓源性抑制細胞水平變化及其對T淋巴細胞增殖的影響研究

張 濤,葛成群

?

·論著·

肺結核患者髓源性抑制細胞水平變化及其對T淋巴細胞增殖的影響研究

張 濤,葛成群

結核，肺；結核分枝桿菌；髓源性抑制細胞；精氨酸；一氧化氮

張濤,葛成群.肺結核患者髓源性抑制細胞水平變化及其對T淋巴細胞增殖的影響研究[J].中國全科醫學，2016，19(35)：4359-4363.[www.chinagp.net]

ZHANG T,GE C Q.Level changes of myeloid-derived suppressor cell and its effect on the proliferation of T lymphocytes among patients with pulmonary tuberculosis[J].Chinese General Practice，2016，19(35)：4359-4363.

肺結核(pulmonary tuberculosis,PTB)是由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性傳染病，MTB可侵及多個臟器，以肺部最為常見。MTB逃脫宿主的免疫防御機制以及對藥物的抗藥性是治療結核病的主要障礙，使得結核病已成為全球發病率和病死率較高的傳染病之一[1]。因此，深入研究PTB發病機制，尋找和研發針對PTB的靶向治療藥物是當前亟須解決的問題。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月—2014年1月于臨沂市人民醫院診斷為活動性PTB患者30例，其中男19例，女11例；年齡18～65歲，平均年齡(47.4±11.5)歲。患者經MTB指示培養基痰液培養呈陽性，并經聚合酶鏈式反應(PCR)確認。選取痰液涂片鏡檢MTB陽性和結核菌素皮膚試驗陽性(TST+)的活動性PTB患者家屬，即接觸PTB患者12例，其中男8例，女4例；年齡22～70歲，平均年齡(46.5±13.0)歲。選取同期經本院結核內科檢查為非結核病的健康對照者15例，其中男7例，女8例；年齡21～68歲，平均年齡(45.5±9.6)歲。選取同期本院痰液涂片鏡檢MTB陰性的肺部感染疾病患者7例，其中男5例，女2例；年齡28～65歲，平均年齡(46.0±10.5)歲。受試者均未接受過免疫抑制治療。受試者均簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 治療 活動性PTB患者和接觸PTB患者經異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇治療2個月，再經異煙肼和利福平單獨治療4個月。痰液涂片鏡檢呈陰性者為治愈，觀察1年后未復發者為康復。

1.3 方法

1.3.1 試劑 CD11b、CD14、CD15、CD33、CD3抗體購自英國Abcam公司；絲裂霉素C、HLA-DR抗體購自美國Sigma公司。

1.3.2 外周血單核細胞(PBMC)和支氣管肺泡細胞(BALC)的制備 參照文獻[12]，取活動性PTB患者、接觸PTB患者和健康對照者外周血，采用葡聚糖密度梯度離心法分離制備PBMC；緩慢滴入0.9%氯化鈉溶液至活動性PTB患者、肺部感染疾病患者肺部，收集支氣管肺泡灌洗液，用Sputasol痰消化液(OXOID，英國)室溫處理15 min后再經100 μm細胞濾網過濾，分離制備BALC。

1.3.3 流式細胞術 PBMC和BALC經FACSFlow平衡緩沖液重懸吹打混勻后，加入熒光素標記的單克隆抗體CD11b、CD14、CD15、CD33、CD3和HLA-DR，4 ℃孵育30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，PBMC用1%多聚甲醛溶液固定，BALC用4%多聚甲醛溶液固定，再重懸于FACSFlow平衡緩沖液中，立即運用流式細胞儀(FACS CANTO Ⅱ，美國)進行流式分選。每個樣本以4.5×105個細胞上流式細胞儀，采用CellQuest流式分析軟件進行細胞分類，記錄MDSC在PBMC和BALC中的比例。按上述方法再次對治療結束的活動性PTB患者、治愈PTB患者和康復PTB患者檢測MDSC在PBMC中的比例。

1.3.4 MDSC形態學觀察 收集部分細胞懸液，按照細胞離心涂片機(Shandon Cytospin 4，美國)說明書制備細胞涂片，500×g離心5 min。制備的細胞涂片經HE染色后在顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.6 高效液相色譜法(HPLC)檢測L-精氨酸、NO、鳥氨酸水平 取活動性PTB患者和健康對照者血樣本以12 300×g離心15 min，去除雜質，收集血清，加入內標物纈氨酸和肌氨酸，吹打混勻制成血清懸液。通過10 K超濾管(0.5 ml,Millipore，美國)進行超濾濃縮去除蛋白，收集濃縮液，運用1200自動進樣器加入鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲氧羰酰氯(FMOC)進行衍生化作用。參照文獻[13]，以標準氨基酸混合物作為OPA衍生物和次級氨基酸混合物作為FMOC衍生物注射進入反相柱，標準氨基酸在激發波長為230 nm，發射波長為455 nm處檢測；次級氨基酸在激發波長為266 nm，發射波長為310 nm處檢測。運用1200系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)進行分離和測定熒光強度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，非正態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義，多重比較調整檢驗水準為0.05/比較次數。

2 結果

2.1 不同受試者MDSC比例比較 活動性PTB患者、接觸PTB患者、健康對照者PBMC中MDSC比例分別為0.338(0.274，0.399)、0.115(0.073，0.201)和0.042(0.031，0.103)，不同受試者PBMC中MDSC比例比較，差異有統計學意義(H=16.450，P<0.001)；其中活動性PTB患者PBMC中MDSC比例高于接觸PTB患者、健康對照者，差異有統計學意義(P<0.001)；接觸PTB患者PBMC中MDSC比例與健康對照者比較，差異無統計學意義(P=0.374)。活動性PTB患者BALC中MDSC比例為0.425(0.219，0.483)，高于肺部感染疾病患者的0.031(0.011，0.100)，差異有統計學意義(Z=9.675，P=0.004)。光學顯微鏡下，MDSC呈規則的圓形或橢圓形(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

圖1 光學顯微鏡下MDSC形態(HE染色，×40)

2.3 血清L-精氨酸、NO、鳥氨酸水平比較 活動性PTB患者血清L-精氨酸水平為31.72(18.37，59.58)μmol/L，低于健康對照者的57.88(35.11，77.93)μmol/L，差異有統計學意義(Z=9.030，P=0.008)。活動性PTB患者血清NO水平為63.54(51.83，81.33)μmol/L，高于健康對照者的30.31(28.19，40.28)μmol/L，差異有統計學意義(Z=10.033，P=0.004)。活動性PTB患者、健康對照者血清鳥氨酸水平分別為47.76(30.72，82.58)μmol/L、52.47(34.32，58.96)μmol/L，差異無統計學意義(Z=0.288，P=0.874)。

2.4 抗PTB治療與MDSC的關系 活動性PTB患者治愈10例，康復5例。治療結束時治愈PTB患者PBMC中MDSC比例為0.024(0.008，0.0389)，低于活動性PTB患者治療期間PBMC中MDSC的比例0.323(0.264，0.388)，差異有統計學意義(Z=18.880，P<0.001)。康復PTB患者PBMC中MDSC比例為0.034(0.018，0.039)，低于其治療結束時PBMC中MDSC的比例0.053(0.017，0.084)，差異有統計學意義(Z=11.125，P=0.004)。

3 討論

既往研究發現，MTB感染部位的MTB特異性T淋巴細胞的數量是周圍未感染部位的10倍[14]。胸膜液中的MDSC顯著增加[11]，而本研究發現BLAC中MDSC比例升高，提示MDSC對MTB感染引起的炎性反應產生免疫應答，從而發揮免疫調節功能。

綜上所述，活動性PTB患者MDSC比例增加，治愈及康復者MDSC比例下降；MDSC可抑制T淋巴細胞增殖，其機制可能與激活NO信號通路有關。MDSC在MTB傳染性疾病中發揮重要的免疫調節作用，通過增強MDSC的免疫調節活性有望成為MTB感染性疾病新的治療手段。但是，MDSC在PTB發病過程中的作用仍不完全清楚。因此，深入了解MDSC在PTB中的作用，為診斷和治療PTB提供新的思路。

作者貢獻：張濤進行課題設計、評估、質量控制及審校，并對文章負責；葛成群進行課題實施、評估、資料收集整理、成文。

本文無利益沖突。

[1]GUPTA A,KAUL A,TSOLAKI A G,et al.Mycobacterium tuberculosis:immune evasion,latency and reactivation[J].Immunobiology,2012,217(3):363-374.

[2]RICH E A，TORRES M,SADA E,et al.Mycobacterium tuberculosis(MTB)-stimulated production of nitric oxide by human alveolar macrophages and relationship of nitric oxide production to growth inhibition of MTB[J].Tuber Lung Dis,1997,78(5/6):247-255.

[3]HERZMANN C,ERNST M,EHLERS S,et al.Increased frequencies of pulmonary regulatory T-cells in latent Mycobacterium tuberculosis infection[J].Eur Respir J,2012,40(6):1450-1457.

[4]YOUNG M R,NEWBY M,WEPSIC H T.Hematopoiesis and suppressor bone marrow cells in mice bearing large metastatic lewis lung carcinoma tumors[J].Cancer Res,1987,47(1):100-105.

[5]GRETEN T F,MANNS M P,KORANGY F.Myeloid derived suppressor cells in human diseases[J].Int Immunopharmacol,2011,11(7):802-807.

[6]OCHOA A C,ZEA A H,HERNANDEZ C,et al.Arginase,prostaglandin and myeloid derived suppressor cells in renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2007,13(2 Pt 2):721s-726.

[7]ALMAND B,CLARK J I,NIKITINA E,et al.Increase production of immature myeloid cells in cancer patients: a machanism of immunosuppression in cancer[J].J Immunol,2001,166(1):678-689.

[8]BRONTE V,ZANOVELLO P.Regulation of immune responses by L-arginine metabolism[J].Nat Rev Immunol,2005,5(8):641-654.

[9]YANG B,WANG X,JIANG J,et al.Identification of CD244-expressing myeloid-derived suppressor cells in patients with active tuberculosis[J].Immunol Lett,2014,158(1/2):66-72.

[11]DU PLESSIS N,LOEBENBERG L,KRIEL M,et al.Increased frequency of myeloid-derived suppressor cells during active tuberculosis and after recent mycobacterium tuberculosis infection suppresses T-cell function[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,188(6):724-732.

[12]EL DAKER S,SACCHI A,MONTESANO C,et al.An abnormal phenotype of lung Vγ9Vδ2 T cells impairs their responsiveness in tuberculosis patients[J].Cell Immunol,2013,282(2):106-112.

[13]SCHUSTER R.Determination of amino acids in biological,pharmaceutical,plant and food samples by automated precolumn derivatization and high performance liquid chromatography[J].J Chromatogr,1998,43(2):271-284.

[14]CHIACCHIO T,PETRUCCIOLI E,VANINI V,et al.Higher frequency of T cell response to M.tuberculosis latency antigen Rv2628 at the site of active tuberculosis disease than in peripheral blood[J].PLoS One,2011,6(11):e27539.

(本文編輯：吳立波)

Level Changes of Myeloid-derived Suppressor Cell and Its Effect on the Proliferation of T Lymphocytes among Patients with Pulmonary Tuberculosis

ZHANGTao,GECheng-qun.

DepartmentofInternalMedicineTuberculosis,LinyiPeople′sHospital,Linyi276034,China

Correspondingauthor：ZHANGTao，DepartmentofInternalMedicineTuberculosis,LinyiPeople′sHospital,Linyi276034,China；E-mail：iamzhangtao1977@163.com

Tuberculosis,pulmonary；Mycobacterium tuberculosis；MDSC；Arginine；Nitric oxide

276034山東省臨沂市人民醫院結核內科

張濤，276034山東省臨沂市人民醫院結核內科；E-mail：iamzhangtao1977@163.com

R 521

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.35.014

2016-03-10；

2016-10-09)