植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)實(shí)踐

張蕓

文件編號： 1003 - 7586（2016）11 - 0052 - 02

在普通高中生物課程標(biāo)準(zhǔn)中對植物組織培養(yǎng)的具體要求是“嘗試植物的組織培養(yǎng)”，建議用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)花卉等幼苗，并進(jìn)行露地栽培。植物組織培養(yǎng)是一項(xiàng)操作復(fù)雜而精細(xì)、難度較大的實(shí)踐活動。從操作的持續(xù)時間來看，該實(shí)驗(yàn)無法在一節(jié)課內(nèi)完成，因此筆者利用課余時間組織興趣小組的學(xué)生利用植物組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)油菜，讓學(xué)生切身感受植物組織培養(yǎng)的全過程，培養(yǎng)了動手操作的能力，這不僅符合新課程倡導(dǎo)探究性學(xué)習(xí)的基本理念，同時為今后班級化大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的開展奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

油菜種子、滅菌的培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞、無菌水、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)罐、酒精燈、光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、解剖刀、鑷子等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 配制MS固體培養(yǎng)基

2.1.1 配制母液

（1） MS大量元素Ⅰ：41.25 g NH4NO3溶化后加8.31 g無水CaCl2，用蒸餾水定容至500 mL；

（2） MS大量元素Ⅱ：47.5 g KNO3與4.25 g KH2PO4分別溶解后混合，用蒸餾水定容至500 mL；

（3） MS大量元素Ⅲ：18.5 g MgSO4·7H2O，用蒸餾水定容至500 mL；

（4） Fe鹽：3.73 g EDTA-Na與2.78 g FeSO4·7H2O，分別溶解后混合，蒸餾水定容至500 mL；

（5） MS微量元素：依次加入下列各藥品，溶解后再加入后一種，最后用蒸餾水定容至500 mL

83 mg KI、620 mg H3BO3、1 690 mg MnSO4·H2O、860 mg ZnSO4·7H2O、25 mg NaMoO4·2H2O、 2.5 mg CuSO4·5H2O、2.5 mg CoCl2·6H2O。

（6） MS維生素：依次加入2 g 肌醇、10 mg 煙酸、10 mg 鹽酸吡哆醛、2 mg 鹽酸硫胺素、40 mg 甘氨酸等藥品后用蒸餾水定容至200 mL。

（7） 6-BA母液：20 mg 6-BA加入0.2 M HCl溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（8） NAA母液：20 mg NAA加入0.2 M NaOH溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（9） 2，4-D母液：20 mg 2，4-D加入0.2 M NaOH溶化，用蒸餾水定容至100 mL；

（10） AgNO3儲液：1.2 g AgNO3加蒸餾水定容至100 mL，過濾滅菌。

（11） 頭孢霉素（Cef）溶液：滅菌蒸餾水配置成250 mg/mL母液；

2.1.2 配制相關(guān)培養(yǎng)基

（1） 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS。

（2） 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS、2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2，4-D。

（3） 分化培養(yǎng)基：MS。

（4） 壯苗培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、6 mg/L AgNO3、50 mg/L Cef。

（5） 生根培養(yǎng)基：1/2 MS。

若配制MS培養(yǎng)基1 L，則MS大量元素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、微量元素、維生素各1 mL，F(xiàn)e鹽2 mL。以上培養(yǎng)基均加蔗糖30 g/L及瓊脂8 g/L，pH調(diào)至6.2。

2.1.3 滅菌及分裝培養(yǎng)基

將配制好的培養(yǎng)基連同其他用具，如培養(yǎng)罐、燒杯、培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子、無菌水、濾紙等相關(guān)物品一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121°C滅菌15～20 min。同時打開超凈工作臺的紫外燈，20 min后關(guān)閉紫外燈并開啟鼓風(fēng)機(jī)。待滅菌鍋氣壓降為0后，將所有物品取出放入超凈工作臺。關(guān)閉超凈工作臺的鼓風(fēng)機(jī)用酒精棉球仔細(xì)擦拭超凈工作臺的臺面及雙手，點(diǎn)燃酒精燈，待培養(yǎng)基冷卻至不燙手時，在酒精燈火焰旁將培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)罐中。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

培養(yǎng)無菌苗：選取子粒飽滿的油菜種子若干，在超凈工作臺中的酒精燈火焰旁，用酒精消毒30 s后，立即用無菌水沖洗3次，再用升汞處理5 min后，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸去種子表面水分后，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱，光照12 h/d。

獲取外植體，并誘導(dǎo)形成愈傷組織：待無菌苗長至7 d，分別切取下胚軸和子葉為外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黑暗中培養(yǎng)，每10 d更換一次培養(yǎng)基。20 d后可見愈傷組織。

誘導(dǎo)生根：將分化約1～2 cm的綠芽切下轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中待分化，芽苗長至3～5 cm時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。

煉苗及移栽：待試管苗根系發(fā)達(dá)時，打開蓋子煉苗3 d后移至花盆中進(jìn)行露地栽培。

3 討論

3.1 植物組織培養(yǎng)基中添加蔗糖的原因

作為碳源和能源物質(zhì)，蔗糖比葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。如配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓明顯低于葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細(xì)胞脫水而生長不良。并且植物細(xì)胞吸收蔗糖的速率比吸收葡萄糖的速率慢很多，所以蔗糖形成的滲透壓可較長時間地保持相對穩(wěn)定。其次從能量供應(yīng)來說，相同物質(zhì)的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。此外，在組培過程中，要特別注意防止培養(yǎng)基受微生物的污染。已知微生物生長所需的碳源最適合的是葡萄糖，而較少利用蔗糖，因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少微生物的污染。

3.2 選擇子葉和下胚軸作為外植體的原因

研究表明，油菜子葉和下胚軸因獲取方便，再生率高、易轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，常被用作誘導(dǎo)愈傷組織及再生芽的理想材料。并且直接用種子培養(yǎng)無菌苗，再以無菌苗的子葉和下胚軸作為外植體，可避免消毒難、培養(yǎng)效果受接種時間等因素的限制。

3.3 脫分化時要避光及再分化時要光照的原因

外植體脫分化形成愈傷組織時需要避光，其目的是為了愈傷組織的形成，如果給予光照，則會不同程度地形成維管組織。愈傷組織是未分化的狀態(tài)，維管組織是已分化的狀態(tài)，若外植體分化成維管組織，則無法繼續(xù)分化成胚狀體，更無法長成植株。而愈傷組織再分化時需要光照，主要是為了葉綠素的形成。因?yàn)橹挥性诠庹諚l件下，植物細(xì)胞中原葉綠素酸脂還原酶才可以將原葉綠素酸脂還原為葉綠素酸脂，后者再進(jìn)一步形成葉綠素。

3.4 培養(yǎng)過程中多次更換培養(yǎng)基的原因

首先，組織培養(yǎng)不同階段所使用的培養(yǎng)基成分是不一樣的，特別是植物激素的組成及比例。其次，培養(yǎng)過程中外植體會產(chǎn)生一些有毒的代謝物，因此需要定期更換培養(yǎng)基，以免影響培養(yǎng)物的生長狀態(tài)。再者，培養(yǎng)過程中可能會受雜菌污染，若染細(xì)菌且菌斑不大，可及時將其他未接觸到菌的外植體換至新的培養(yǎng)基中。

3.5 組培苗移栽前煉苗的原因

組培苗雖具有一定的光合能力，但處于高濕、弱光、低CO2、恒溫、異養(yǎng)條件下生長，其組織分化不完善，光合自養(yǎng)能力弱，氣孔多且不易關(guān)閉、葉綠素少、根毛少。移栽前煉苗則是為了逐步改變其生長條件使其組織發(fā)育完全，以適應(yīng)外界環(huán)境。