金黃色葡萄球菌經(jīng)靜脈和腹腔誘導(dǎo)小鼠血流感染的炎癥反應(yīng)和病理變化

吳 丹 周樹生 胡仕靜 劉 寶

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，合肥230001)

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金黃色葡萄球菌經(jīng)靜脈和腹腔誘導(dǎo)小鼠血流感染的炎癥反應(yīng)和病理變化

吳 丹 周樹生 胡仕靜 劉 寶①

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，合肥230001)

目的：建立簡單可靠的金黃色葡萄球菌血流感染小鼠模型，探討血流感染小鼠的炎癥反應(yīng)和病理變化。方法：C57BL/6小鼠分別通過靜脈或腹腔注射金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以誘導(dǎo)血流感染；觀察各組小鼠生存率、體重變化及膿毒癥評分(MSS)；進行血樣本及組織勻漿培養(yǎng)以確定細菌負荷；ELISA法檢測血清或組織勻漿中的CRP、PCT及細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平；同時觀察各組小鼠肝、肺、腎臟的病理改變及病理炎癥評分。結(jié)果：4.5×108CFU/ml金黃色葡萄球菌血流感染小鼠的生存率約為70%。感染后24 h，小鼠體重明顯減輕，MSS明顯升高，且靜脈組高于腹腔組。WBC于感染后3 h顯著升高；感染后48 h血清CRP、PCT水平達到峰值，分別為靜脈組：60.80±5.63、6.796±1.16，腹腔組：40.58±7.54、2.740±0.36；血清及組織勻漿(肝、肺、腎)中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平均有不同程度的升高，且靜脈組高于腹腔組。感染12 h后開始出現(xiàn)肝、肺、腎組織不同程度的病理炎癥改變，且病理炎癥評分隨之顯著升高。結(jié)論：成功建立金黃色葡萄球菌小鼠血流感染模型，比較靜脈及腹腔兩種途徑的炎癥反應(yīng)強度及病理改變，有助于進一步探討血流感染的早期診斷及臨床治療預(yù)后。

金黃色葡萄球菌；血流感染；炎癥；細胞因子；組織病理學(xué)

各種細菌、病毒、真菌及其他微生物充斥著環(huán)境，并在我們免疫力低下時造成不同程度的感染。當(dāng)今世界，嚴重感染已經(jīng)成為威脅人類健康的致死性疾病之一，尤其是在重癥監(jiān)護病房(ICUs)有著更高的發(fā)病率[1]。最近的報道認為革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌引起的重癥感染有著越來越高的發(fā)生率，其導(dǎo)致了肺部感染、消化道感染、泌尿道感染、皮膚軟組織感染，甚至血流感染(BSIs)[2]。當(dāng)血流感染發(fā)展為多器官衰竭的膿毒癥或膿毒性休克時，其成為ICU感染死亡的重要原因。一些研究認為膿毒癥死亡率為20%～30%[2]，盡管臨床上對其有著廣泛的研究以及治療方案的發(fā)展，膿毒癥及相關(guān)死亡的發(fā)生率仍在上升[3]，尤其是金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的BSIs呈顯著增加[4]。隨著金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的BSIs的增加，更好的理解金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病機理，對發(fā)展臨床有用的治療方法和改善預(yù)后顯得尤為重要和有價值。目前，已有幾種膿毒癥動物模型，它們都試圖模擬膿毒癥病人典型的病理生理改變[5]。其中一些是輸入外源性內(nèi)毒素或者活菌以造成毒血癥或菌血癥，另一些包括盲腸結(jié)扎和穿孔法(CLP)及其他的腹部膿毒癥[6]。在我們的研究中，我們建立了一種簡便但有價值的模型，即通過給C57BL/6小鼠尾靜脈或腹腔注射金黃色葡萄球菌的方法，比較兩者炎癥應(yīng)答和病理變化，以助于理解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的BSIs發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 S.aureus 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213 由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床微生物實驗室惠贈。

1.1.2 實驗動物 SPF級C57BL/6 雄性小鼠(20～25 g,6～8周) ，購自安徽省實驗動物中心[SCXK(皖)2011-002)]。動物飼養(yǎng)于ASBL2動物室，實驗前適應(yīng)環(huán)境一周。

1.1.3 儀器和材料 血細胞分析儀(Coulter LH 750，美國Beckman Coulter公司)，小鼠CRP、PCT ELISA試劑盒(美國LifeDiagnostics公司)，小鼠IL-1β、 IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 菌株于LB培養(yǎng)液中37℃搖菌過夜，然后以1∶100(v/v) 稀釋于新鮮LB中繼續(xù)搖菌4～6 h。菌液離心(3 000 r/min，5 min)后重懸于無菌PBS離心，反復(fù)三次，麥?zhǔn)媳葷岱ù_定菌液濃度。

1.2.2 確定最適感染濃度 每組小鼠分別尾靜脈和腹腔注射等劑量的不同濃度(4.5×109、4.5×108、4.5×107、4.5×106、4.5×105和4.5×104CFU/ml)的細菌菌液，每組5只，注射量為0.1 ml/10 g，連續(xù)觀察7天，每日觀察小鼠發(fā)病和死亡情況。按Karber方法計算LD50作為最適感染濃度。

1.2.3 感染實驗 選擇上述LD50的濃度感染小鼠，小鼠隨機分為1、3、6、12、24、48、72、96、120、168 h實驗組(靜脈組和腹腔組) 及PBS對照組，每組5只，共150只，注射量0.1 ml/10 g，記錄體重、癥狀、死亡情況，每組小鼠麻醉后收集血液標(biāo)本檢測WBC、CRP、PCT、IL-1β、 IL-6、TNF-α及細菌菌落計數(shù)，收集肝臟、肺臟、腎臟進行組織勻漿的IL-1β、 IL-6、TNF-α檢測，以及組織的HE染色。小鼠膿毒癥評分(MSS)用于血流感染后的臨床癥狀評分，病理炎癥評分(PIS)用于HE染色后的組織急性炎癥評分。MSS評分包括七項單獨的標(biāo)準(zhǔn)，即外表、意識狀態(tài)、活動力、對刺激的反應(yīng)、眼睛分泌物、呼吸頻率、呼吸質(zhì)量，每一項分別有0～4分，最終評分包括四項的總分[7]。PIS評分主要用于評估組織HE切片中炎癥細胞(主要是中性粒細胞和巨噬細胞)的數(shù)量，分為4個等級：0=沒有或者極少數(shù)的細胞，1=少量松散的細胞，2=血管周圍多數(shù)的細胞，3=血管周圍滿布細胞，最終評分包括各個組織的評分總和[8]。

2 結(jié)果

2.1 最適感染濃度的確定 利用比濁儀計數(shù)在1.5左右時確定細菌計數(shù)為4.5×108CFU/ml細菌數(shù)。用不同濃度的菌液感染小鼠，觀察周期7d，靜脈注射4.5×109CFU/ml組的小鼠全部死亡，4.5×108CFU/ml和4.5×107CFU/ml組的生存率分別為 70% 和90%，其余各組全部生存；腹腔注射4.5×109CFU/ml組的小鼠全部死亡，4.5×108CFU/ml組的生存率為80%，其余各組全部生存,見圖1。

2.2 小鼠感染后的癥狀表現(xiàn) 靜脈組和腹腔組感染的小鼠體重均在48h出現(xiàn)明顯的下降，并隨時間的推移逐漸減輕，但靜脈組更為顯著，而PBS對照組小鼠體重逐漸增加。靜脈組小鼠在感染后3h即出現(xiàn)豎毛，活動減少等表現(xiàn)，并隨時間的延長逐漸出現(xiàn)萎靡、對刺激反應(yīng)遲鈍、眼睛有膿性分泌物、呼吸急促或微弱，甚至死亡等，而腹腔組僅在數(shù)天以后出現(xiàn)輕微的上述癥狀，PBS對照組無上述癥狀，靜脈組小鼠MSS評分自3h開始較腹腔組有顯著意義的增加，見表1。

2.3WBC、CRP和PCT水平的變化 靜脈各組WBC在3h后顯著升高，而腹腔各組在12h后明顯升高；感染小鼠的CRP在12h后明顯升高，持續(xù)至96h，PCT在12h后明顯升高，持續(xù)至120h，且靜脈各組在同一時間段高于腹腔各組，見表2。

圖1 不同濃度金黃色葡萄球菌菌液感染小鼠后7天生存曲線Fig.1 Percent survival of mice with different concentrati-ons S.aureus within 7 daysNote: 1.Mice were infected with 4.5×109 CFU/ml,4.5×108 CFU/ml,4.5×107 CFU/ml,4.5×106 CFU/ml,4.5×105 CFU/ml and 4.5×104 CFU/ml S.aureus respectively (n=10/group).A.IV infected；B.IP infected.

2.4 血標(biāo)本和組織勻漿中細菌計數(shù) 靜脈組和腹腔組在感染1h～168h各個時間點的血標(biāo)本及組織勻漿(肝、肺、腎)經(jīng)培養(yǎng)后均見有細菌生長，且隨著感染時間的延長，各組細菌計數(shù)逐漸增加，達到感染高峰(96h～120h)后又呈下降趨勢，且靜脈感染各組細菌計數(shù)明顯高于腹腔感染各組，見表3。

2.5 各組小鼠血漿及組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 靜脈感染各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平較腹腔各組的血漿及組織勻漿升高，幾乎所有細胞因子的峰值都出現(xiàn)在6～24h，然而腎臟勻漿中IL-1β峰值在48～72h,肝臟和腎臟勻漿中IL-6及腎臟勻漿中TNF-α水平在7d的觀察時間內(nèi)持續(xù)地升高，見表4～7。

表1 各組小鼠的平均體重和膿毒癥癥狀評分(MSS)

Tab.1 Body weight and MSS of mice(MSS)

TimenWeight(g)(x±s)IVIPMSS(x±s)IVIPPIS(x±s)IVIP0h1020.60±1.3520.70±1.340.00±0.000.00±0.000.04±0.250.03±0.121h1020.52±1.6320.88±1.510.25±0.080.17±0.081.60±1.140.40±0.553h1020.53±1.7020.73±1.401.07±0.122)0.75±0.084.80±1.303)1.20±0.846h1020.43±1.5520.80±1.451.69±0.102)1.06±0.044.60±1.343.40±1.1412h1020.43±1.1921.08±1.772.24±0.282)2.17±0.087.20±0.843)6.00±0.7124h1020.30±1.0921.23±1.927.73±0.122)5.56±0.107.60±1.346.20±0.8348h1019.88±1.051)20.96±1.888.99±0.672)7.53±0.098.40±0.896.80±1.4372h1019.00±0.921)20.45±1.579.73±0.272)7.57±0.156.40±0.553)4.60±0.5796h1018.07±1.101)20.20±0.9413.51±2.152)8.72±0.136.20±0.453)3.80±0.84120h1017.10±1.451)19.70±1.5616.15±0.122)9.08±0.084.60±0.563.00±1.87168h1015.00±0.711)19.60±1.8220.04±0.122)9.15±0.222.69±0.571.80±0.84

Note：1)P<0.01,2)P<0.001,3)P<0.05.

TimenWBC(×109L-1)IVIPCRPlevels(μg/ml)IVIPPCTlevels(ng/ml)IVIP0h101.81±1.041.21±0.353.20±0.623.22±0.610.036±0.020.038±0.021h101.70±1.911.71±1.143.28±0.533.04±0.650.048±0.040.036±0.023h104.44±0.701)1.20±0.653.32±0.533.12±0.660.049±0.040.038±0.026h105.68±0.721)2.74±0.976.00±0.794.50±0.790.202±0.060.098±0.0112h107.09±0.361)3.89±0.5922.90±5.662)13.40±3.402.000±0.382)0.347±0.0824h107.34±0.401)4.55±0.4938.40±6.512)23.94±4.613.962±0.342)1.246±0.2848h109.13±0.451)5.20±0.7260.80±5.632)40.58±7.546.796±1.162)2.740±0.3672h1010.44±0.851)7.26±0.4930.96±5.872)21.50±8.284.684±0.662)2.280±0.3996h1013.71±1.291)8.46±1.3015.00±4.062)11.56±3.312.496±0.562)1.344±0.35120h1011.75±1.678.85±1.024.66±0.684.30±0.920.806±0.972)0.276±1.13168h1010.68±1.479.32±1.193.52±0.403.57±0.700.064±0.010.185±0.36

Note：1)P<0.01,2)P<0.001.

TimenBlood(×106L-1)IVIPLiver(×106L-1)IVIPLung(×106L-1)IVIPKidney(×106L-1)IVIP1h200.07±0.030.06±0.050.03±0.040.05±0.040.03±0.050.04±0.040.00±0.000.02±0.033h201.08±0.071.05±0.020.15±0.130.20±0.220.21±0.230.11±0.180.10±0.100.05±0.096h202.18±0.122.15±0.970.08±0.870.15±0.080.08±0.040.09±0.100.17±0.080.07±0.0612h204.15±0.363.78±0.590.20±0.160.13±0.040.11±0.080.07±0.050.20±0.100.08±0.0324h208.34±1.406.55±1.491.00±0.350.53±0.131.44±0.491)0.56±0.210.42±0.140.40±0.1048h209.43±2.457.20±0.971.93±1.051.05±0.263.86±1.551.40±0.721.08±0.521.00±0.2572h2042.34±2.852)17.26±1.4915.03±3.751)7.38±1.696.93±1.016.40±0.697.50±2.501)1.50±1.0096h2070.61±1.492)20.36±2.5051.50±2.412)11.25±1.5011.07±1.012)4.93±1.0113.67±1.262)3.50±1.32120h2089.85±2.672)23.45±2.3233.75±3.752)15.63±2.8616.27±1.622)5.87±2.0120.33±2.022)8.67±1.26168h2067.58±1.972)15.02±0.7920.50±1.892)9.25±1.8917.60±2.622)6.93±1.0120.83±5.202)3.67±1.26

Note：1)P<0.01,2)P<0.001.

TimenIL-1β(pg/ml)IVIPIL-6(pg/ml)IVIPTNF-α(pg/ml)IVIP0h108.72±1.018.72±0.9487.78±6.4088.99±7.3319.59±2.0719.91±2.261h1024.66±2.902)19.48±1.681102.30±85.781014.10±82.2126.34±2.3024.97±1.223h1077.00±5.291)66.60±5.942676.03±95.602577.85±55.04104.02±4.492)90.20±3.706h10170.78±4.632)150.00±7.913254.03±50.291)3117.30±59.12229.08±7.422)193.60±6.1112h10187.30±5.701)177.60±5.593127.63±96.851)2988.03±39.62173.20±6.461)160.00±7.2124h1050.80±4.6649.60±6.54509.62±26.661)458.13±25.8344.20±5.1237.00±6.0848h109.30±1.798.90±1.1988.80±7.9886.01±9.6222.80±3.9620.80±3.1972h109.27±0.788.73±0.9293.52±6.3189.74±7.4623.60±4.5119.40±2.3096h108.86±0.808.53±0.9493.60±4.7790.80±4.5522.80±3.5620.01±1.87120h109.29±0.619.00±0.7488.18±11.7490.60±9.5620.23±2.5520.40±2.79168h108.76±1.078.98±0.8690.88±8.0290.40±7.9620.25±1.6919.19±1.29

Note：1)P<0.05,2)P<0.01.

TimenIL-1β(pg/ml)IVIPIL-6(pg/ml)IVIPTNF-α(pg/ml)IVIP0h105.00±1.113.00±2.102.00±0.001.00±002.00±2.071.50±2.081h101801.01±247.281561.53±281.2715.00±1.4115.23±5.0034.80±9.9426.01±7.753h102120.03±168.062370.13±448.2347.61±13.461)27.81±5.63517.82±58.171)440.18±46.866h102578.03±139.672)2141.30±113.49219.26±22.542)158.02±10.371341.13±45.952)974.26±59.2612h102942.08±264.232)2086.03±128.37500.20±72.112)344.03±48.27712.27±52.592)568.09±44.2124h102696.63±124.212)1957.13±105.45770.20±84.262)544.00±48.27182.83±14.292)139.02±16.7348h101808.13±123.301900.09±145.40918.02±58.052)688.04±52.6434.61±19.8923.76±13.7572h101475.83±205.541296.03±213.071250.03±180.282)842.00±51.1911.01±5.165.00±1.1896h10728.16±53.39377.22±49.731720.30±135.092)1057.83±95.254.00±4.444.05±3.32120h10685.43±74.492)353.87±45.452110.43±167.302)1231.63±149.313.60±1.044.45±0.79168h10256.33±56.69193.35±47.272290.03±159.692)1240.03±216.282.23±1.291.19±1.89

Note：1)P<0.05,2)P<0.01.

TimenIL-1β(pg/ml)IVIPIL-6(pg/ml)IVIPTNF-α(pg/ml)IVIP0h107.12±3.879.16±1.4262.60±7.8364.33±7.7934.01±1.5834.33±1.371h10462.92±88.692)227.24±49.9379.60±8.5673.61±9.50106.20±9.5464.01±11.933h101269.53±62.891)595.98±98.36440.00±78.18340.02±80.39420.02±75.361)177.72±56.116h101646.63±69.152)1005.52±92.28990.02±151.662)664.00±119.291100.01±171.562)550.02±76.7812h10756.68±82.91671.66±20.981768.03±97.152)1050.23±112.141870.03±158.852)1126.03±135.5724h10663.09±75.492)219.60±61.241448.03±69.762)860.02±108.391200.00±158.11970.04±92.3548h10205.50±39.902)42.60±15.43238.00±63.07157.00±65.53310.02±67.33208.02±62.5772h1048.80±34.9525.60±28.2766.21±12.1361.00±6.52130.02±40.6767.21±12.9196h105.00±8.111.90±6.0763.60±4.7257.81±5.4957.21±10.3238.80±6.76120h103.29±0.652.00±3.9055.40±11.2854.01±8.2241.20±2.5934.01±2.45168h105.76±1.094.98±1.8652.21±7.6953.41±8.8233.10±4.8433.80±3.56

Note：1)P<0.05,2)P<0.01.

TimenIL-1β(pg/ml)IVIPIL-6(pg/ml)IVIPTNF-α(pg/ml)IVIP0h1015.00±4.1214.72±3.472.34±4.402.67±3.331.95±3.072.06±1.261h1020.39±9.3812.91±7.927.76±6.344.10±2.2120.00±6.9810.01±4.143h1042.59±14.5625.88±18.7131.01±9.8110.11±8.4529.00±7.8120.09±9.036h1061.49±24.6741.54±12.8145.40±26.0421.00±9.4942.80±9.7434.09±9.8112h10246.81±39.99226.82±54.75112.02±21.962)65.01±16.9651.80±5.811)34.80±11.9424h10714.06±54.63707.83±64.62536.00±61.072)259.05±37.8163.61±6.111)44.81±15.2148h101976.73±213.121854.23±194.391260.03±119.372)666.02±88.2097.60±5.592)59.80±9.1872h101701.63±53.491)915.43±52.631340.09±118.362)750.67±79.06242.02±31.942)133.20±31.5496h10410.78±55.931)321.03±87.961)1810.09±96.182)1140.30±155.72421.62±36.372)257.02±35.99120h10224.45±46.13219.90±29.922130.30±233.452)1446.63±164.56608.02±49.692)340.45±38.08168h1065.68±13.994.11±15.781830.03±177.491506.03±224.00757.80±67.852)521.62±41.75

Note：1)P<0.05,2)P<0.01.

圖2 靜脈組和腹腔組小鼠三種器官的大體病理變化Fig.2 Gross pathological changes of three organs of IV and IP group miceNote: Lungs,liver and kidneys were observed at 48 h to 168 h post-infection in IV and IP infected mice.Organs of PBS control group were also observed.In lungs and liver,arrow indicates hemorrhage on the surface of tissues.In kidneys,arrows indicate abscesses on the surface.

圖3 靜脈組、腹腔組及PBS對照組小鼠器官的HE病理變化(×400)Fig.3 Representative photomicrographs of HE-stained organs from BSIs or PBS control mice(×400)Note: Sections from the lungs,liver and kidneys of infected mice at 12 h-120 h post-infection and PBS control mice were examined respectively.Arrow indicates neutrophil infiltration;asterisk indicates tissue necrosis.

2.6 小鼠臟器組織病理學(xué)觀察結(jié)果

2.6.1 大體觀察 在肺組織和肝組織中，感染后48～168 h靜脈組和腹腔組均表現(xiàn)為肺臟和肝臟的出血，尤其在72～96 h，且靜脈組更為明顯；在腎組織中，感染后48～168 h靜脈組和腹腔組均表現(xiàn)為腎臟充血腫大，且在72～120 h靜脈組還表現(xiàn)為多發(fā)腎膿腫，見圖2。

2.6.2 HE染色觀察 金黃色葡萄球菌感染后12 h鏡下開始觀察到各組織的炎癥變化，靜脈組的肺、肝、腎組織在感染后12～120 h表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤及不同程度組織的壞死，而腹腔組僅表現(xiàn)為不同程度炎癥細胞浸潤，未見明顯組織壞死，見圖3。

2.6.3 病理炎癥評分結(jié)果 感染組各時間段均表現(xiàn)為評分的顯著提高，且靜脈組與腹腔組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3 討論

近年來，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的血流感染逐年上升，已嚴重威脅人類健康[9]。一些涉及膿毒癥機制的研究已經(jīng)為我們提供了改善患者預(yù)后的方向，然而，對于其潛在的病理生理機制仍理解甚少。建立簡單可靠的動物模型是進一步研究的基礎(chǔ)，CLP法被認為是目前研究膿毒血癥最常見的動物模型[6]，然而CLP法通過盲腸結(jié)扎和穿孔造成腹腔感染播散而形成全身血流感染，其主要是革蘭氏陰性桿菌或混合細菌的感染，而對于研究特定細菌的血流感染則存在局限性，我們的研究建立了簡單易行的尾靜脈或腹腔注射金黃色葡萄球菌，并成功摸索最適感染濃度，造成穩(wěn)定的血流感染模型，該動物模型可進一步推廣，研究其他特定細菌或者多種已知細菌混合感染后的炎癥應(yīng)答及病理變化。

CRP及PCT被認為是炎癥及感染的生物標(biāo)志之一。我們的實驗結(jié)果表示血流感染組較對照組CPR及PCT水平顯著升高，并分別開始于6 h及3 h，兩者分別達高峰于24～48 h及12～24 h，這些與國內(nèi)外相關(guān)研究相符[10-12]，且靜脈感染組明顯高于腹腔感染組。

先前的實驗已經(jīng)證明，膿毒癥時患者體內(nèi)細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平顯著提高。我們的實驗表明血流感染小鼠血清及組織勻漿中(肝、肺、腎)上述三種細胞因子均顯著提高，且靜脈感染組高于腹腔感染組，而且還發(fā)現(xiàn)除了肝、腎組織勻漿中IL-6及腎組織勻漿中TNF-α水平在觀察周期7 d內(nèi)保持持續(xù)上升外，其余血清及組織勻漿中的細胞因子基本于感染后12～24 h達到高峰，這一結(jié)果與國外相關(guān)文獻報道一致[10，13]。這可能是由于血清及各種組織中分泌的不同細胞因子的特性或者觀察時間限制引起的，所以進一步有關(guān)細胞因子的機制作用有待研究。

我們觀察到血流感染的小鼠組織細胞顯著的病理學(xué)改變，如炎癥細胞(中性粒細胞及巨噬細胞)浸潤以及組織壞死等，這與Elif Cadirci等[8]的研究結(jié)果相似，而另一些研究認為膿毒癥小鼠腎臟的病理改變較肺臟及肝臟明顯[14，15]，這可能與不同膿毒癥模型的特性有關(guān)。病理炎癥評分已被用于評估急性炎癥感染程度，我們的結(jié)果與已有的研究結(jié)果一致，即血流感染組的評分遠高于未感染組[16]，且靜脈組高于腹腔組。

感染后小鼠血液及組織勻漿中培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌能夠確定小鼠發(fā)生血流感染及播散至組織器官。我們的實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔感染的小鼠血液及組織中的細菌計數(shù)明顯少于經(jīng)靜脈感染組，且各組血液培養(yǎng)出的細菌計數(shù)少于組織器官，這可能是由于血液中的補體系統(tǒng)及溶酶體能夠直接吞噬一部分細菌，而已擴散至組織器官的細菌可以不斷繁殖[17]。

體重的減輕被認為是膿毒癥小鼠營養(yǎng)不良的表現(xiàn)之一。我們的實驗結(jié)果與國外的研究一致，在血流感染后24 h發(fā)現(xiàn)小鼠體重顯著下降或者不升，直至死亡或到達觀察周期，而對照組小鼠的體重持續(xù)增長。我們還發(fā)現(xiàn)在感染后的24～48 h，體重的下降與細胞因子的上升相一致。這可能有以下解釋：IL-1β有直接抑制食物攝取的作用，也有間接調(diào)節(jié)IL-1R的作用[18]；TNF-α同樣受IL-1R表達的影響，參與體重調(diào)節(jié)[19]；此外，IL-6誘導(dǎo)發(fā)熱，被認為是調(diào)節(jié)體重增長的重要因子[20]。

我們通過靜脈及腹腔注射兩種途徑建立了金黃色葡萄球菌血流感染的小鼠模型，并比較兩組小鼠的炎癥反應(yīng)及病理學(xué)改變，有助于進一步探明血流感染的病理生理學(xué)機制，并指導(dǎo)臨床診斷治療及預(yù)后。

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[收稿2015-07-10 修回2015-07-23]

(編輯 倪 鵬)

Mechanism of inflammatory responses and histopathological changes in Staphylococcus aureus induced bloodstream infections in mice

WU Dan,ZHOU Shu-Sheng,HU Shi-Jing,LIU Bao.Department of Critical Care Medicine,Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230001,China

Objective:To establish mice models of Staphylococcus aureus bloodstream infections so as to investigate the inflammatory responses and histopathological changes in bloodstream infections(BSIs) mice.Methods: C57BL/6 mice were inoculated with S.aureus intravenously or intraperitoneally to induce BSIs.Survival rate,weight loss and murine sepsis scores(MSS) were observed.Blood samples and tissue homogenates were plated on agar to determine bacterial burden.Inflammatory proteins(CRP,PCT) and cytokines(IL-1β,IL-6 and TNF-α) were determined by ELISA kits.Histopathologic changes were also assessed by pathological inflammation scores(PIS),macroscopic and microscopic examination.Results: About 70% survival rate was observed in 4.5×108CFU/ml S.aureus induced BSIs mice.Body weight decreased and sepsis scores increased significantly since 24 h post-infection in BSIs mice,and more prominent in IV group.The counts of WBC began to significantly increase at 3 h post-infection,while CRP and PCT levels peaked at 48 hours in IV and IP groups (60.80±5.63 vs 40.58±7.54 for CRP;6.796±1.16 vs 2.740±0.36 for PCT).Moreover,the levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in serum and tissue homogenates(liver,lungs,and kidneys) were significantly elevated in BSIs mice.Pathological changes in tissues(liver,lungs and kidneys) and higher pathological inflammation scores(PIS) were also observed in BSIs mice.Conclusion: Our study represents an effective approach for S.aureus BSIs model to mimic human sepsis.Our results demonstrated that inflammation protein(PCT,CRP) and cytokines(IL-6,IL-1β and TNF-α) play an important role in the inflammatory response and histopathological changes during BSIs caused by S.aureus.

Staphylococcus aureus;Bloodstream infections;Inflammation;Cytokines;Histopathology

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.024

吳 丹(1988年-)，女，碩士，主要從事細菌感染與免疫方面研究。

R378.1

A

1000-484X(2016)04-0556-07

①通訊作者，E-mail：DrLiubao@outlook.com。

指導(dǎo)教師：周樹生(1973年-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事重癥感染細菌耐藥方面研究。