金絲桃苷增強人γδT細胞增殖及殺傷功能研究①

李 瑩 周 燏 孫蕾清 周忠海 呂小婷 徐 明 李 昳 劉軍權

(解放軍第九七醫院生物治療中心，徐州221004)

?

金絲桃苷增強人γδT細胞增殖及殺傷功能研究①

李 瑩 周 燏②孫蕾清 周忠海 呂小婷 徐 明③李 昳④劉軍權

(解放軍第九七醫院生物治療中心，徐州221004)

目的：研究金絲桃苷對人γδT細胞增殖及功能的影響。方法：以異戊烯焦磷酸法體外擴增人外周血γδT細胞。用不同濃度的金絲桃苷處理，CCK-8法檢測細胞增殖。LDH法檢測金絲桃苷對前列腺癌細胞DU-145的殺傷活性。流式細胞儀檢測處理前后γδT 細胞上穿孔素、顆粒酶、CD107a、IFN-γ的表達情況。結果：異戊烯焦磷法能在體外成功培養出高純度的 γδT細胞。金絲桃苷在μg/ml范圍內可顯著促進γδT細胞增殖。金絲桃苷作用于γδT 細胞后殺傷DU-145的能力明顯增強，且在3.13～12.5μg/ml濃度時 γδT 細胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達顯著升高，與對照組相比有統計學差異。金絲桃苷對γδT細胞上CD107a的表達無明顯影響。結論： 金絲桃苷通過增強γδT細胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達來增強其殺傷DU-145的作用。

金絲桃苷；γδT細胞；DU-145；殺傷功能

金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種從天然植物中提取的黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于各種植物體內，如金絲桃科、薔薇科、桔?？频裙麑嵟c全草中。以往的研究發現金絲桃苷具有多種藥理活性，如抗炎[1]、抗肝損傷[2]、抗血栓[3]、體外抗腫瘤[4-6]并增強機體的免疫功能，而且幾乎無毒副作用[7]等。γδT主要分布于小腸、皮膚等黏膜組織，是臨床常用的重要免疫效應細胞之一。目前關于金絲桃苷對免疫效應細胞的作用鮮有報道，本實驗旨在研究金絲桃苷對γδT細胞增殖及殺傷功能的影響，以期為金絲桃苷的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 金絲桃苷(Hyperoside，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；FITC標記的anti-TCR-gamma-delta、PE標記的穿孔素(Perforin)和顆粒酶(GranB)、APC標記的CD-107a、Fix&Perm破膜劑、PE-IgG1、APC- IgG1均購自eBioscience公司；APC標記的IFN-γ購自美國BD公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所；重組人白細胞介素2(rhIL-2)購自廈門特寶生物工程股份有限公司；異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)，RPMI-1640培養基、小牛血清購自Gibco公司；人AB型血漿購自徐州市血站。人前列腺癌細胞株DU-145購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 γδT細胞培養及鑒定 取健康志愿者外周抗凝血20 ml，常規分離得到單個核細胞(PBMC)，將PBMC置于含100 ml/L小牛血清、50 ml/L AB血清、異戊烯焦磷酸(2 μg/L)和rhIL- 2(100 U /ml)的RPMI1640培養液中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養10 d，用anti-TCR-gamma-delta-FITC標記后用流式細胞儀檢測γδT細胞比例。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取培養10 d的γδT細胞調整細胞濃度至1 × 109L-1，以180 μl接種于96孔板中，并加入金絲桃苷20 μl(終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.6、0.8、0.4、0.2 μg/ml)，同時設0.5%DMSO溶媒對照組，每組設3個復孔。培養68 h后每孔加入CCK-8 20 μl,繼續培養 4 h后于450nm處測定光密度值(OD )。

1.4 LDH法檢測殺傷活性 以乳酸脫氫酶法檢測γδT細胞的殺傷活性[8]。將金絲桃苷 50、12.5、3.13、0.8、0.2 μg/ml濃度處理72 h的γδT細胞作為效應細胞。收集對數生長期的DU-145細胞做為靶細胞，按效靶比10∶1的比例將兩者混合，同時設單獨效應細胞孔、單獨靶細胞孔，于37℃、5% CO2培養箱中培養6 h，離心收集上清在全自動生化分析儀340nm處測定吸光值(A)，按下式計算殺傷活性。殺傷活性(%)=[(實驗孔A值-效應細胞自然釋放孔A值)/(靶細胞最大釋放孔A值-靶細胞自然釋放孔A值)]×100%。

1.5 流式細胞儀檢測γδT細胞上顆粒酶、穿孔素、CD107a和IFN-γ的表達 將γδT細胞調整細胞濃度，以每孔1× 106個/3 ml接種至6孔板內，加入金絲桃苷(終濃度為50、12.5、3.13、0.8、0.2 μg/ml)，同時設溶媒對照組，每組3個復孔，于37℃、5% CO2培養箱中培養72 h。收集細胞洗滌，檢測CD107a和IFN-γ的試管內分別加入FITC-anti-TCR-gamma-delta、APC-CD107a和FITC-anti-TCR-gamma-delta、APC-IFN-γ，避光孵育15 min，PBS洗滌2次，棄上清，0.5 ml PBS重懸細胞，上機檢測。測顆粒酶或穿孔素的管內，加入FITC-anti-TCR-gamma-delta避光孵育10 min，再加入固定液孵育15 min，PBS洗滌，棄上清，加入破膜劑、PE-GranB或PE -Perforin，避光孵育15 min，PBS洗滌2次，棄上清，0.5 ml PBS重懸，上機檢測。

2 結果

2.1 人γδT細胞培養和鑒定 取培養10d的γδT細胞顯微鏡下觀察，可見大的細胞集落，單個細胞呈條梭狀。經流式細胞儀檢測，γδT細胞的比例可達91.3%，提示γδT細胞培養成功。見圖1。

2.2 金絲桃苷對γδT細胞增殖的影響 由圖2可看出，金絲桃苷對γδT細胞增殖有一定的影響，在較低濃度(0.2～1.6μg/ml)時，金絲桃苷對細胞增殖影響不明顯。在3.13～12.5μg/ml濃度范圍內可顯著促進細胞增殖，與對照組相比有統計學意義。隨著濃度的不斷升高，金絲桃苷對細胞增殖出現抑制，在100μg/ml濃度時與對照組相比有顯著性差異，因此，在后續實驗中，選擇了0.2～50μg/ml的濃度范圍。

圖1 培養前后γδT細胞比例Fig.1 Proportion of γδT cells before and after culture

圖2 金絲桃苷對γδT細胞增殖影響Fig.2 Effect of Hyperoside on γδT cells proliferationNote: *.P<0.05,VS 0 group.

圖3 金絲桃苷對γδT細胞殺傷功能的影響Fig.3 Cytotoxicity of γδT cells treated by Hyperoside Note: *.P<0.05,**.P<0.01 VS 0 group.

圖4 金絲桃苷對γδT細胞上顆粒酶表達的影響Fig.4 Expression of GranB on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of GranB on γδT cells after treated by Hyperoside；B1.Isotype control；B2.0 group；B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.

圖5 金絲桃苷對γδT細胞上穿孔素表達的影響Fig.5 Expression of Perforin on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of Perforin on γδT cells after treated by Hyperoside；B1.Isotype control；B2.0 group；B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.

圖6 金絲桃苷對γδT細胞上CD107a表達的影響Fig.6 Expression of CD107a on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of CD107a on γδT cells after treated by Hyperoside；B1.Isotype control；B2.0 group；B3.Hyperoside 12.5 μg/ml.

圖7 金絲桃苷對γδT細胞上IFN-γ表達的影響Fig.7 Expression of IFN-γ on γδT cells after treated by HyperosideNote: A.The expression of IFN-γ on γδT cells after treated by Hyperoside；B1.Isotype control；B2.0 group；B3.Hyperoside 12.5 μg/ml;*.P<0.05 VS 0 group.

2.3 殺傷活性檢測結果 金絲桃苷作用于γδT細胞72h后，對DU-145的殺傷活性有一定程度的提高，在12.5μg/ml濃度時殺傷活性最強，與對照組相比有顯著性差異。見圖3。

2.4γδT細胞上顆粒酶、穿孔素、CD107a、IFN-γ的表達結果 經金絲桃苷處理72h后，γδT細胞上顆粒酶、穿孔素、IFN-γ的表達都有一定改變，在12.5μg/ml濃度下，三者的表達都顯著高于對照組。金絲桃苷對γδT細胞上CD107a的表達影響不明顯。見圖4～7。

3 討論

目前有關金絲桃苷的抗腫瘤作用成為研究的熱點。金絲桃苷不僅能在體外抑制多種腫瘤細胞株增殖，還能在體內增強機體的免疫功能。黃凱等[9]研究初步發現給予正常小鼠12.5mg/kg金絲桃苷即可增強其非特異性和特異性免疫。王麗敏[10]的研究發現金絲桃苷在小劑量(1.5mg/kg)時就對荷瘤小鼠有抑瘤作用，隨著劑量增加抑瘤效果逐漸提高，最高可達約65%。

然而金絲桃苷對免疫效應細胞的作用還少有報道，我們之前報道過金絲桃苷增強共刺激細胞殺傷胃癌的研究[11]，本課題主要研究金絲桃苷對γδT細胞增殖及功能的影響。γδT細胞主要分布于皮膚、小腸、食道等黏膜上皮內，在免疫調節、免疫監視中起關鍵作用，因此也是腫瘤生物治療中常用的免疫效應細胞。CCK-8實驗結果表明在3.13～12.5μg/ml濃度范圍內金絲桃苷可顯著促進γδT細胞增殖，隨著濃度增加則抑制細胞增殖，因此選擇0.2～50.0μg/ml濃度范圍進行后續實驗。在殺傷實驗中，我們發現經金絲桃苷預處理過的γδT細胞對前列腺癌DU-145的殺傷能力較未處理組明顯增強，在12.5μg/ml時達峰值。

為了進一步驗證γδT細胞的殺傷功能的改變，我們用流式細胞儀檢測了處理前后γδT細胞上與其特異性殺傷活性密切相關的成分穿孔素、顆粒酶、CD107a及INF-γ的表達情況。穿孔素是存在于CTL、NK和γδT細胞胞質中的細胞毒顆粒。當這些細胞與靶細胞接觸后可釋放穿孔素， 在靶細胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，導致靶細胞溶解[12]。顆粒酶B是CTL和NK細胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，可以進入靶細胞，激活caspase級聯反應，從而迅速引起靶細胞DNA的斷裂,導致快速的細胞凋亡[13]?？乖禺愋訲細胞表面的CD107a分子，與抗原特異性細胞活化以后的脫顆粒過程密切相關，可能是CTL脫顆粒以后，細胞溶解性顆粒的胞膜與T細胞膜融合所致[14]。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節的作用[15]。本研究中我們發現金絲桃苷能明顯提高γδT細胞上顆粒酶、穿孔素和IFN-γ表達，分別從73.39%、60.15%、73.6%提高至83.84%、76.81%、83.8%，而對CD107a的表達無明顯影響。

綜上所述，本課題初步研究了金絲桃苷對γδT細胞的影響，發現金絲桃苷在一定濃度范圍內可以促進γδT細胞增殖，并增強其殺傷能力，以期為金絲桃苷的進一步開發應用提供依據。

[1] Ku SK,Zhou W,Lee W,etal.Anti-inflammatory effects of hyperoside in human endothelial cells and in mice[J].Inflammation,2015,38(2):784-799.

[2] Choi JH,Kim DW,Yun N,etal.Protective effects of hyperoside against carbon tetrachloride-induced liver damage in mice[J].J Nat Prod,2011,74(5):1055-1060.

[3] Ku SK,Kim TH,Lee S,etal.Antithrombotic and profibrinolytic activities of isorhamnetin-3-O-galactoside and hyperoside[J].Food Chem Toxicol，2013,53:197-204.

[4] 王麗敏,李 爽,張明遠,等.金絲桃苷對人結腸癌HCT8細胞生長周期、細胞凋亡及對Caspase蛋白活性的影響[J].時珍國醫國藥，2012,23(12)，3010-3011.

[5] Li FR,Yu FX,Yao ST,etal.Hyperin extracted from Manchurian rhododendron leaf induces apoptosis in human endometrial cancer cells through a mitochondrial pathway[J].Asian Pac J Cancer Prew,2012,113(8):3653-3656.

[6] 孫時華,姜榮華,祝海燕,等.金絲桃苷體外抗胃癌作用及其機制研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2014,19(9)：979-983.

[7] 艾 國,黃正明,王德文,等.金絲桃苷對Wistar大鼠重復灌胃給藥的毒性研究[J].中國新藥雜志,2012,21(23):2811-2826.

[8] 劉軍權，韓慧敏，陳復興.用乳酸脫氫酶試劑盒檢測LAK細胞活性[J].臨床醫學檢驗，1995，13:83.

[9] 黃 凱,楊新波,黃正明,等.金絲桃苷對正常小鼠免疫功能的影響[J].解放軍藥學學報,2009,25(2)：133-135.

[10] 王麗敏,王躍新,朱秋雙,等.金絲桃苷對荷瘤小鼠腫瘤抑制作用研究[J].黑龍江醫藥科學,2010,44(2)：62-63.

[11] 代培培,陳劍群,劉軍權,等.金絲桃苷增強共刺激細胞殺傷胃癌細胞MKN-45的研究[J].國際免疫學雜志，2014,37(3)：242-249.

[12] Urrea Moreno R,Gil J,Rodriguez-Sainz C,etal.Functional assessment of perforin C2 domain mutations illustrates the critical role for calcium-dependent lipid binding in perforin cytotoxic function[J].Blood,2009,113(2):338-346.

[13] Prakash MD,Bird CH,Bird PI.Active and xymogen forms of granzyme B are constitutively released from cytotoxic lymphocytes in the absence of target cell engagement[J].Immunol Cell Biol,2009,87(3):249-254.

[14] Betts MR ,Brenchley JM,Price DA,etal.Sensitive and viable identification of antigen specific CD8+T cells by a flowcytometric assay for degranulation [J].J Immunol Methods,2003,281(1-2):65-78.

[15] Schroder K,Hertzoq PJ,Ravasi T,etal.Interferon-gamma:an overview of signals,mechanisms and functions[J].J Leukoc Biol.2004,75(2):163-189.

[收稿2015-06-25 修回2015-07-29]

(編輯 倪 鵬)

Enhancement of γδT cells proliferation and cytotoxicity by Hyperoside

LI Ying,ZHOU Yu,SUN Lei-Qing,ZHOU Zhong-Hai,Lü Xiao-Ting,Xu Ming， LI Yi,LIU Jun-Quan.Biological Therapy Center,the 97 Hospital of Chinese PLA,Xuzhou 221004,China

Objective:To investigate the anti-tumor effect of Hyperoside.Methods: Human γδT cells were amplified by isopentenyl pyrophosphate from peripheral blood cells.The proliferation capacity of γδT cells was measured with CCK-8 assay after treated with different concentrations of Hyperoside.Cytotoxicity of γδT cells was detected with LDH assay,and the expression of granzyme,perforin CD107a and IFN-γ on γδT cells were measured by flow cytometry before and after treatment.Results: Hyperoside could significantly stimulate the proliferation of γδT cells at the concentration of 3.13-12.5 μg/ml.Cytotoxicity and expression of granzyme,perforin and IFN-γ of γδT cells were increased after treatment.Conclusion: Hyperoside could enhance cytotoxicity of human γδT cells through up-regulation of granzyme,perforin CD107a and IFN-γ expression.

Hyperoside;γδT cells;DU-145 cell;Cytotoxicity

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.016

①本文為南京軍區醫學科技創新課題(11MA040)資助項目。

李 瑩(1986年-)，女，護師，主要從事護理工作，E-mail:115530179@qq.com。

及指導教師：劉軍權(1960年-)，男，副主任技師，主要從事腫瘤生物治療研究，E-mail:595716758@qq.com。

R979.5

A

1000-484X(2016)04-0524-04

②并列第一作者。

③解放軍第九七醫院干部病房，徐州221004。

④解放軍第九七醫院檢驗科，徐州221004。