MMS2和P53基因對結腸癌細胞增殖與凋亡的影響①

馬琳園 隋 御 馬 璐 李 昕 李元杰 徐 方

(寧夏醫科大學寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室，銀川750004)

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MMS2和P53基因對結腸癌細胞增殖與凋亡的影響①

馬琳園 隋 御 馬 璐 李 昕 李元杰 徐 方

(寧夏醫科大學寧夏回族自治區生殖與遺傳重點實驗室，銀川750004)

目的：探討MMS2 siRNA 與P53 siRNA 對人高分化結腸癌細胞(THC-8307)的增殖與凋亡的相互調控作用。方法：以實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、蛋白印跡法(Western blot)分析檢測細胞轉染效率，選擇沉默效率具有統計學意義的THC-8307細胞作為實驗組，同時將未作處理的THC-8307作為空白對照，轉染空質粒細胞作為陰性對照。采用qRT-PCR及Western blot分別檢測干擾各組目的基因后其兩基因相互關系及表達量。采用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，以明確其對結腸癌細胞增殖與凋亡的作用。結果：實驗組與對照組相比，分別沉默MMS2基因與P53基因的結腸癌細胞內P53與MMS2的 mRNA與蛋白水平顯著升高(P<0.05)。沉默MMS2實驗組其早期凋亡與晚期凋亡率增加(P<0.05)。結論：MMS2和P53在結腸癌細胞增殖與凋亡方面起反向調控作用。

MMS2;P53;RNA干擾;人結腸癌細胞;細胞凋亡

結腸癌(Colorectal cancer,CRC)是常見的惡性腫瘤之一。據最新統計學分析顯示，全球范圍內，結腸癌的發病率和死亡率均位列第三位[1]，新增病例以每年超過100萬例的速度遞增[2]。在我國，結腸癌是最常見的惡性腫瘤,僅次于胃癌和食道癌并且逐年來其發病率呈上升趨勢 ，在部分發達城市甚至已經達到消化道腫瘤的第二位[3,4]。既往研究表明，致癌物的暴露所導致的基因突變以及由基因突變累積引起的細胞突變是結直腸癌發生的根本原因[5],機體對此會進行自我修復——DNA損傷耐受修復(DNA-damage tolerance，DDT)，曾經被稱為復制后修復(Post replication repair，PRR)。根據基因分析，DDT被劃分為兩個途徑，一條是易誤性修復(Error-prone)，另外一個是無誤性修復(Error-free)[6]。其中MMS2是無誤性途徑中的主要基因之一，它與腫瘤的形成和發生發展密切相關，已有實驗提示在哺乳動物模型中MMS2與UBC13所形成的復合物在P53介導的DNA損傷應答中起重要作用，主要是調節癌細胞的增殖和凋亡[7]。為證實這一實驗現象，并闡明機理，本實驗擬用RNA干擾技術分別靶向降低MMS2基因和P53基因在結腸癌細胞THC-8307中的表達，觀測其相互關系，檢測其對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響，為結腸癌的臨床治療提供前期理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀(上海風嶺，中國)；電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；DNA提取試劑盒(TIAN-GEN);超敏型二步法免疫細胞化學試劑(一抗 Abcam，美國)；HRP 標記二抗(中杉金橋生物技術有限公司，北京)；全蛋白提取試劑盒；lipo3000(Invitrogen，美國)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BestBio 中國)等。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 人高分化結腸癌細胞(THC-8307)由天津醫科大學生命科學中心實驗室湯華教授惠贈。根據Genebank查閱MMS2和P53基因已知基因序列，設計siRNA序列(表1)。重組質粒由上海松正生物科技有限公司構建完成。

1.2.2 細胞培養及分組處理 將THC-8307細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，傳代培養。取對數生長期的細胞進行轉染，按照Lipofecta mineTM3000 試劑盒(Invitrogen)說明書進行操作。實驗分為三組，將含有MMS2干擾片段的質粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)含有P53干擾片段的質粒(pcDNA6.2-GW/EmRFP-miR-P53)轉染至THC-8307細胞中作為實驗組細胞，同時轉染相應陰性質粒作為對照組，不做任何處理的THC-8307細胞作為空白對照組。同樣條件下培養48 h，進行后續實驗。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測MMS2、P53 mRNA的表達 在Pubmed數據庫中查詢MMS2和P53基因以得到其編碼序列，采用Premier 5.0設計相關引物(表2)。為避免基因組DNA污染，引物設計原則為上下游引物跨兩個外顯子[8]。將提取的各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA,逆轉錄反應條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min。再以cDNA為模板進行熒光定量PCR,反應條件為：95℃10 min；95℃ 15 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s，40個循環。3次實驗結果通過比較CT值法(2-△△CT)進行相對定量分析。

1.2.4 Western blot 檢測MMS2、P53蛋白的表達 采用蛋白裂解液提取細胞的全蛋白，取20 μl進行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉膜1 h后，用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。將膜與anti-MMS2和anti-P53于4℃孵育過夜，HRP標記二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像儀上成像分析，以β-actin為內參，計算MMS2和P53與內參β-actin灰度值的比較，進行分析。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 各處理組細胞按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作說明收集細胞并進行染色操作后，迅速用流式細胞儀進行凋亡率檢測。經FCM分析結果。

2 結果

2.1siRNA-MMS2和siRNA-P53轉染效率檢測 用LipofectamineTM3000 轉染siRNA-MMS2和siRNA-P53于THC-8307細胞，24h后用倒置顯微鏡觀察可分別見綠色和紅色熒光分散在細胞質中說明轉染成功(圖1)

2.2siRNA-MMS2干擾效能鑒定

2.2.1 MMS2基因在細胞中mRNA表達量的變化qRT-PCR結果顯示：siRNA-MMS2轉染進入THC-8307細胞48h后，細胞中MMS2基因量明顯低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05，圖2)，而兩對照組之間則無統計學意義(P>0.05)。結果表明：小RNA干擾片段成功抑制實驗組細胞MMS2基因的表達，而陰性質粒對MMS2基因的表達無多少影響。

表1 RNA干擾序列

Tab.1 RNA interference sequence

RNAinterferencesequenceMMS2F:5'-TGCTGCTTGGTGGCCCAATAATCATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATGATTAGGGCCACCAAG-3'R:5'-CCTGCTTGGTGGCCCTAATCATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATGATTATTGGGCCACCAAGC-3'P53F:5'-TGCTGAGTAGATTACCACTGGAGTCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGACTCCAGGTAATCTACT-3'R:5'-CCTGAGTAGATTACCTGGAGTCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGACTCCAGTGGTAATCTACTC-3'

表2 熒光引物

Tab.2 Fluorescence primer

FluorescenceprimerMMS2F:5'-CGGTCTCCACAGGAGTTAAAGT-3'R:5'-TGTCCAGGTCATGTTTACCAGC-3'P53F:5'-GCTCTGACTGTACCACCATCCACTA-3'R:5'-TCTTGCGAAGATTCTCTTCCTCTGT-3'

2.2.2MMS2基因在細胞中蛋白表達量的變化 細胞轉染48 h后，Western blot檢測THC-8307細胞中MMS2蛋白的表達(圖3)，顯示實驗組細胞MMS2表達量明顯低于兩對照組(P<0.05)，而兩對照組之間則無統計學意義(P>0.05)。本實驗結果說明：在蛋白水平上MMS2基因成功被沉默，而陰性質粒對其表達無影響。

2.3 siRNA-P53干擾效能鑒定

圖1 siRNA-MMS2與siRNA-P53熒光顯微鏡下觀察轉染效率(10×20)Fig.1 Observed transfection efficiency under fluorescence micriscope(10×20)Note: Figure A and B were transfected into siRNA-MMS2 cells by fluorescence inverted microscope and ordinary optical field of vision.Figure C and D were transfected into siRNA-P53 cells by fluorescence inverted microscope and ordinary optical field of vision.Figure A and C,the white arrow indicates that the THC-8307 cells were transfected successfully.

圖2 siRNA干擾MMS2 mRNA 的相對表達水平Fig.2 Relative expression of MMS2 mRNA after silenced by siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.3.1P53基因在細胞中mRNA表達量的變化 qRT-PCR結果表明：siRNA-P53轉染進入細胞48 h后，細胞中P53基因量明顯低于兩對照組(P<0.05，圖4)，而陰性對照組與空白對照組之間則無統計學意義(P>0.05)。結果表明：小RNA干擾片段成功抑制實驗組細胞P53基因mRNA表達，而陰性質粒對P53 mRNA的表達并無多少影響。

2.3.2P53基因在細胞中蛋白表達量的變化 細胞轉染48 h后，Western blot檢測THC-8307細胞中P53蛋白的表達(圖5)，顯示實驗組細胞P53表達量明顯低于兩對照組(P<0.05)，而兩對照組之間的差異則無統計學意義(P>0.05)本實驗說明：在蛋白水平上P53基因下調成功，而陰性質粒對其表達無影響。

2.4 下調MMS2對THC-8307細胞P53表達量的影響

圖3 siRNA干擾MMS2蛋白的相對表達水平Fig.3 Relative expression of MMS2 protein after silenced by siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

圖4 siRNA干擾P53 mRNA 的相對表達水平Fig.4 Relative expression of P53 mRNA after silenced by siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.4.1 下調MMS2的實驗組細胞培養48 h后，用qRT-PCR檢測THC-8307細胞P53 mRNA表達量，顯示實驗組P53 mRNA表達量明顯高于空白對照組與陰性對照組(P<0.05)，而兩對照組之間則無統計學差異(P>0.05)，見圖6。

2.4.2 以Western Blot檢測下調MMS2 48 h之后THC-8307細胞中P53蛋白表達量，結果顯示，實驗組P53蛋白表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，而兩對照組之間則無統計學差異(P>0.05)，見圖7。

2.5 下調P53對THC-8307細胞MMS2表達量的影響

2.5.1 用下調P53之后繼續培養48 h的THC-8307細胞作為實驗對象，以qRT-PCR檢測細胞中MMS2 mRNA的表達量，結果顯示，實驗組MMS2mRNA表達顯著高于空白對照組與陰性對照組(P<0.05),而兩對照組之間則無統計學差異(P>0.05)(見圖8)。

圖5 siRNA干擾P53蛋白的相對表達水平Fig.5 Relative expression of P53 protein after silenced by siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖6 siRNA干擾MMS2后，P53 mRNA 的相對表達水平Fig.6 Relative expression of P53 mRNA after silenced by MMS2-siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.5.2 以Western blot檢測下調P53 48 h之后THC-8307細胞中MMS2蛋白表達量，結果顯示，實驗組MMS2蛋白表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05),而兩對照組之間則無統計學差異(P>0.05)，見圖9。

2.6 下調MMS2基因對細胞增殖和凋亡的影響

2.6.1 流式細胞術分析Annexin V-FITC/PI 熒光染色結果 經轉染48 h后，將THC-8307細胞置入流式細胞分析儀中，結果顯示，與兩對照組相比，實驗組早期凋亡率和晚期凋亡率均增高，差異有統計學意義(P<0.05)，空白對照組與陰性對照組之間則無顯著性差異(P>0.05)，見圖10。

圖7 siRNA干擾MMS2后，P53蛋白的相對表達水平Fig.7 Relative expression of P53 protein after silenced by MMS2-siRNA determined Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group MMS2-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖8 siRNA干擾P53后，MMS2 mRNA 的相對表達水平Fig.8 Relative expression of MMS2 mRNA after silenced by P53-siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖9 siRNA干擾P53后，MMS2蛋白的相對表達水平Fig.9 Relative expression of MMS2 protein after silenced by P53-siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖10 流式細胞儀檢測THC-8307各組細胞凋亡率(%)Fig.10 Quantitative analysis of THC-8307 cells apoptotic determined by FACS(%)Note: A and C represent apoptosis of cells after silencing MMS2；B and D represent apoptosis of cells after silencing P53.Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group；P53-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

3 討論

結腸癌的傳統治療方法是以手術加放/化療為主，由于其對患者機體損傷較大，且不能從本質上根治結腸癌，有約40%～50%的患者會出現術后復發或轉移,其中大多數患者失去再治愈的機會[9]。因此以RNA干擾為主的生物技術手段就成為臨床治療的主攻方向。MMS2是一種泛素結合酶樣蛋白基因，在結構上，MMS2對UBC13介導的lys63連接聚泛素化鏈的長度的調節作用，在功能上，UBC13-MMS2復合物作用于DNA損傷修復，即DNA損傷耐受通路DDT(DNA damage tolerate)通路中的無誤性(error-free)修復途徑[10]。損傷耐受可以發生在復制叉或者復制叉后，以防止復制叉崩潰和潛在的細胞死亡，因為它的主要作用是保證復制的進行而不是等待損壞的模板進行修復[11]。同時，我們發現UV損傷引起嘧啶二聚體導致單鏈DNA缺口，經過復制后修復這些缺口依然長期存在，表明PRR只是繞過損傷而不是修復它[12]，DNA損傷途徑與細胞突變及腫瘤的發生發展密切相關[13]。其分子機制可能與下游基因的同源重組有關[14,15]。研究發現，人類MMS2與酵母MMS2同源，定位于人染色體8p，MMS2是正常細胞生長所必需的[16]。本實驗室前期實驗已經發現，沉默MMS2基因表達可以促進結腸癌細胞自發凋亡，抑制增殖，提示TLS介導的腫瘤細胞損傷后修復過程可能有凋亡機制的參與[17]。這與Knobel[18]發現TLS可以對P53凋亡信號通路中的調控分子表達和功能失常引起腫瘤細胞凋亡的報道相一致。推測，在沉默MMS2誘導結腸癌細胞THC-8307凋亡過程中P53發揮重要作用。

本研究通過開展qRT-PCR、Western blot等實驗研究和相關文獻分析，發現下調MMS2之后，結腸癌細胞中P53表達量顯著升高，細胞在早期與晚期凋亡量增加，提示P53所在的凋亡信號通路在該過程中發揮一定作用。與此同時，我們還發現下調P53之后，結腸癌細胞THC-8307中MMS2在轉錄水平與蛋白水平表達量會顯著上升，但是結腸癌細胞THC-8307的早期凋亡與晚期凋亡卻沒有明顯的改變。這些實驗現象提示，下調MMS2誘導結腸癌細胞THC-8307凋亡或許就是通過激活P53實現的。這也與Wen和 Li等[7]在2012年研究發現脊椎動物的MMS2基因具有高度保守性，并且指出斑馬魚DrMMS2基因是一個與哺乳動物MMS2基因真正同源的基因,在以斑馬魚為脊椎動物代表的實驗研究中發現，在斑馬魚細胞中P53介導的DNA損傷反應，需要DrMMS2和UBC13形成穩定的絡合物,且發現敲除DrMMS2基因的細胞，P53的表達量顯著上升，并得出結論斑馬魚DrMMS2基因在反向調控P53基因活性方面起重要作用的報道相一致。同時，另有報道指出[19]，MMS2與UBC13復合物介導K63連接聚泛素化的P53，有利于單體P53的形成，還可以降低P53的轉錄活性，而這種調控作用在DNA損傷時減弱，使P53激活，且MMS2編碼產物在大多正常組織中表達量極低，但是在一些腫瘤組織中呈不同水平的高表達[13]。有實驗指出P53低表達可能參與了結腸癌的形成過程，其低表達的結腸癌細胞更具有惡性分化潛能[20]。本課題組前期研究發現MMS2不但參與DNA損傷修復，而且還與遺傳不穩定性及其腫瘤的發生有關[16,21]，而P53在基因穩定性方面又被稱作是“基因守護衛士”[22]，同時，周期檢測位點與TLS通路密切相關，其對于無論是無誤性修復通路還是易誤性修復通路都非常重要[23]。以上研究一定程度上證實，在結腸癌細胞凋亡中,MMS2和P53基因在轉錄水平和蛋白水平其相互間似乎是起反向調控作用，該作用可能與TLS對細胞周期檢測位點的調控有關，具體機制尚需后續實驗進一步研究。

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[收稿2015-10-20 修回2015-12-10]

(編輯 張曉舟)

Interaction between MMS2 and P53 on proliferation and apoptosis of colon cancer cells

MA Lin-Yuan,SUI Yu,MA Lu,LI Xin,LI Yuan-Jie,XU Fang.Ningxia Medical University,Ningxia Key Laboratory of Reproductive and Genetic，Yinchuan 750004,China

Objective:To explore the regulatory effects of proliferation and apoptosis on THC-8307 byMMS2 siRNA andP53 siRNA. Methods: We experimentally suppressed theMMS2 andP53 expression in human colon cancer cells by the interference RNA technology(RNAi)as monitored by Real-time qRT-PCR and Western blot.THC-8307 cells that express rate significantly reduced were collected as case group,while using untreated cells as the blank control group,and mock-treated cells as the negative control group.After separately interfering the target genes in each group,test the relationship and expression level of the two genes.Utilizing flow cytometry techniques to test cells proliferation and apoptosis rate of each group.Results: Compared to the control group,colon cancer cells in whichMMS2 andP53 were silenced displayed significant increase ofP53,MMS2 mRNA and protein levels(P<0.05).MMS2-depleted cells displayed increase in apoptosis rates,for both early and later stages(P<0.05). Conclusion:MMS2 andP53 negatively regulate each other in colon cancer cells proliferation and apoptosis.

MMS2;P53;RNA-interference;Human colon cancer cells;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.014

①本文為國家自然科學基金資助項目(No.313602501)。

馬琳園(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事DNA損傷修復和腫瘤發生發展的研究。

及指導教師：徐 方(1962年-)，女，博士生導師，主要從事DNA損傷修復與腫瘤發生發展的研究。

R735.35

A

1000-484X(2016)04-0513-06