清絡通痹方調控miRNA網絡干預類風濕關節炎的研究①

朱亞梅 周玲玲 彭孝武 耿 姍 周學平

(南京中醫藥大學，南京210023)

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·中醫中藥與免疫·

清絡通痹方調控miRNA網絡干預類風濕關節炎的研究①

朱亞梅 周玲玲 彭孝武 耿 姍 周學平②

(南京中醫藥大學，南京210023)

目的：觀察清絡通痹方(QLT)對膠原性關節炎(CIA)小鼠miRNA網絡的調控作用，探討其干預類風濕關節炎的機制。方法：DBA/1小鼠，復制CIA模型，隨機分為空白對照、CIA、QLT組，采用miRCURYTM LNA Array芯片技術篩選外周血miRNA異常表達譜，以Realtime PCR對異常變化的miRNAs進行驗證，并利用多種生物信息學軟件進行分析。結果：與空白對照組比較，CIA小鼠具有差異表達的miRNAs有221個；與CIA比較，QLT差異表達的miRNAs有169個。RT-PCR驗證結果與芯片檢測所示具有較好的一致性。PCR結果顯示CIA中miR-143下調明顯，而QLT干預可明顯上調miR-143的表達水平。miR-143靶基因顯著富集在VEGF、T細胞受體、MAPK信號通路等信號通路中。結論：多種miRNA的異常表達參與CIA的病理過程，QLT可能通過干預miRNA調控網絡，多環節、多途徑干預RA免疫、炎癥、疼痛等多種病理過程，miR-143可能作為QLT治療RA的重要環節。

miRNA；膠原性關節炎；清絡通痹方

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種臨床常見的風濕免疫性疾病，主要表現為自身免疫的紊亂，進而引起滑膜炎和骨質破壞。微小 RNAs(microRNAs,miRNAs)作為一類內源性、短鏈非編碼RNA主要功能是調節蛋白編碼基因的表達，越來越多的研究揭示miRNA調控網絡在自身免疫性疾病的發病機理中扮演著十分重要的角色[1]，并且大量研究發現在RA關節滑膜組織以及滑液成纖維細胞中miR-155、miR-146a、miR-203等多種miRNA 的表達失調。清絡通痹方(Qingluo Tongbi Compound,QLT)由生地黃、青風藤、三七、炙僵蠶、雷公藤組成，為國醫大師周仲瑛教授臨床應用幾十年的經驗方，針對RA臨床常見的“陰虛絡熱證”，具有養陰清熱、祛風除濕、活血祛瘀、化痰散結的作用。前期研究提示QLT可通過抑制細胞因子網絡紊亂、調控多條信號通路抑制RA免疫功能的紊亂和滑膜炎癥[2，3]，從多環節、多途徑干預RA。單個miRNA可調控生物體內多個基因的表達，而QLT亦具有類似的多靶點調控的特點，因此我們推測QLT能通過調節miRNA的表達干預RA病理過程。本研究將應用高通量miRNA表達譜芯片分析膠原性關節炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型組和QLT給藥組miRNA的差異表達，并通過數據整合和應用系統生物學分析方法進一步挖掘數據中的生物學功能信息，為進一步認識QLT干預RA機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 清絡通痹方水提液由江蘇省植物藥研究與新藥開發中心提供，清絡通痹方水提液含生藥1.29 g/ml，使用前蒸餾水稀釋。

不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s adjuvant,IFA，美國Sigma公司,批號12401);完全弗氏佐劑(Complete Freund′s adjuvant,CFA，美國sigma公司,批號12441)；牛Ⅱ型膠原(type II collagen,CⅡ，美國Chondrex公司，批號130217)；Trizol試劑(美國Life Technologies公司，批號79403)；miRCURYTM Array Power Labeling kit(丹麥Exiqon公司,批號208032-A)； miRCURYTM Array,Wash buffer kit(丹麥Exiqon公司,批號208021)。

1.1.2 儀器 熒光定量PCR(羅氏公司 型號：Lishtcycler96)；紫外分光光度計(USA Thermo公司 型號：ND-1000)；Axon GenePix 4000B 掃描儀(Axon Instruments,Foster City,CA)；GenePix Pro 6.0 軟件(Axon,CA)。

1.1.3 動物 DBA/1小鼠，雄性，6～8周，9只，常州卡文斯動物公司提供[SCXK(蘇)2011-0003]，試驗在南京中醫藥大學實驗動物中心內完成，室溫(23±3)℃，濕度40%～70 %。動物給予全價顆粒飼料(江蘇協同醫藥生物有限公司供給)喂養，自由飲水，每日光照/黑暗各12 h。動物適應性飼養3 d后進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠的制備[4]將牛CⅡ溶于0.01 mol/L的醋酸中，配制成2 g/L溶液，4℃震蕩過夜，將溶解的CⅡ與CFA以1∶1比例混，并充分乳化(在冰上操作)。在DBA/1 小鼠尾根靠后處皮內注射100 μl CⅡ與CFA 的混合乳劑進行初次免疫，當天記為d1。到d21用CⅡ與IFA等比混勻，尾根部注射100 μl進行加強免疫。

1.2.2 分組及給藥 隨機分為3組，每組3只:空白對照組(Normal)不予任何處理，其余組復制CIA模型，分為CIA組，清絡通痹方組(QLT)8.7 g/kg，空白對照組和CIA組給予等體積生理鹽水，QLT 組d21起每日灌胃給藥1次，給藥4周后，眼眶取血，-80℃冰箱保存。

1.2.3 總RNA抽提 將處理好的樣本中加入Trizol混合按Trizol 說明抽提總RNA，并測定RNA濃度和純度。

1.2.4 MiRNA芯片分析 采用miRCURYTM Array Power Labeling kit標記，然后應用miRCURYTMLNA Array(v.18.0)進行芯片雜交。雜交后芯片用Wash buffer kit進行洗片，具體步驟按各試劑盒說明書進行。采用Axon GenePix 4000B掃描儀對雜交后芯片進行掃描,使用GenePix Pro6.0軟件對掃描圖像所得原始數據分析，通過原始值減去背景值來做修正，并用中值做標準化芯片上每個探針的綠色信號強度經過去背景化后，并將4個重復探針取平均值，用中位數標準化的方法對數據進行標準化處理，組間信號值進行比較，比值>1.5為表達上調，<0.5為表達下調。

1.2.5 real-time PCR 采用Primer 5.0設計引物，引物序列見表1，按照試劑盒指定操作步驟擴增，進行real-time PCR反應，PCR程序為：95℃，10 min；40個PCR循環[95℃，10 s；60℃，60 s(收集熒光)]。擴增反應結束后，按 (95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-Ramp Rate為0.05℃/s)建立PCR產物的熔解曲線。獲得擴增曲線及CT值。各樣品的目的miRNA和內參(mmu-miR-425-5p)分別進行realtime PCR反應。采用mmu-miR-425-5p作為實驗的內參基因進行歸一化，數據采用2-△△ CT法進行分析，設置 3 個平行復孔，檢測結果取平均值。

表1 實時定量RT-PCR引物

Tab.1 List of primers used in Real time PCR

miRNAPrimersequencemmu-miR-425-5pGSP:5'GGGGAATGACACGATCACTC3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'mmu-miR-183-5pGSP:5'GGGTATGGCACTGGTAGAA3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'mmu-miR-203-3pGSP:5'GGGGTGAAATGTTTAGGA3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'mmu-miR-122-5pGSP:5'GGGTGGAGTGTGACAATGG3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'mmu-miR-143-3pGSP:5'GGGATGAGATGAAGCACT3'R:5'TGCGTGTCGTGGAGTC3'

Note：GSP.Corresponding to the specific primers of micrornas；R.The primers match the RT primers.

1.2.6 生物信息學分析 應用miRanda、Target-Scan、miRRDB、miRWalk、RNA22靶基因預測網站預測靶基因，取三者交集的靶基因以最大程度的降低預測假陽性率，利用Cytoscape中的插件BINGO對 mmu-miR-143 預測靶基因集合進行功能注釋(Gene Ontology ，GO)富集分析，并采用 DAVID 數據庫，對預測靶基因集合進行基于KEGG數據庫的生物通路富集分析。

2 結果

2.1RNA提取結果 各RNA樣本的A260/A280比值均在1.6～1.9之間，提示各樣本中總RNA純度良好，符合miRNA芯片的質量要求，保證了下一步實驗的順利進行。

2.2miRNA芯片篩選結果miRNA芯片提示：與正常對照組小鼠比較，CIA組小鼠具有差異表達的miRNA有221個，其中115個miRNAs表達上調(↑)，106個miRNAs表達下調(↓)；與CIA組比較，QLT組差異表達的miRNA有169個，93個miRNAs表達上調(↑)，76個miRNAs表達下調(↓)。CIA/Normal與QLT/CIA具有反向作用的miRNA共49個，QLT干預可上調其表達水平的miRNA有36個，其中20個miRNAs變化明顯(CIA/Normal下調變化倍數<0.5，QLT/CIA上調變化倍數>1.5倍)，見表2；QLT干預可下調其表達水平的miRNA有13個，其中6個miRNAs變化明顯(CIA/Normal上調>1.5倍，QLT/CIA下調變化倍數<0.5)，見表3。

2.3real-timePCR芯片結果驗證 為檢測芯片結果的真實可靠性從芯片結果中選取4個差異表達的miRNA進行real-timePCR，對芯片結果進行初步驗證，結果顯示CIA組與空白對照組相比，mmu-miR-183-5p、mmu-miR-203-3p、mmu-miR-143-3p、mmu-miR-122-5p變化倍數CIA/Normal<0.5倍，表達均上調(圖1A)，QLT/CIA變化倍數>1.5倍，清絡通痹方干預均可下調其表達(圖1B)，結果顯示，所選miRNA在芯片結果中的表達均與RT-PCR變化倍數表達情況一致，如圖1，說明本研究的芯片結果基本真實可靠。

PCR結果顯示：空白對照組miR-143相對表達量為1.52±0.44，CIA組中miR-143相對表達量為0.59±0.23，與空白對照組相比CIA組miR-143下調明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)；QLT組其相對表達量為1.08±0.08，與CIA組相比miR-143表達水平上調，差異顯著(P<0.05)，如圖2。

表2 清絡通痹方具有上調干預作用miRNA的變化倍數

Tab.2 Fold changes of miRNAs up-regulated by QLT

miRNAFoldchange(CIA/Normal)Foldchange(QLT/CIA)mmu-miR-29a-5p0.469507014↓1.699634138↑mmu-miR-181a-5p0.402391583↓2.093295151↑mmu-miR-27a-3p0.450875355↓1.588985215↑mmu-miR-183-5p0.428255255↓1.900674813↑mmu-miR-20b-5p0.495110635↓2.096817098↑mmu-miR-33-5p0.420156433↓2.024470612↑mmu-miR-194-5p0.306229664↓2.327504931↑mmu-miR-203-3p0.305148223↓1.801923623↑mmu-miR-199a/199b-3p0.344007709↓2.240078583↑mmu-miR-335-5p0.199094743↓2.907107386↑mmu-miR-19a-3p0.415888524↓1.914543554↑mmu-miR-32-5p0.31344649↓2.239427598↑mmu-miR-101a/c-3p0.413383695↓3.109887676↑mmu-miR-195a-5p0.419610889↓1.978721831↑mmu-miR-122-5p0.194012485↓2.238766954↑mmu-miR-344i0.228540999↓2.055180739↑mmu-miR-215-5p0.380389709↓2.484540029↑mmu-miR-544-5p0.446442457↓1.731614896↑mmu-miR-301a-3p0.437327066↓1.919305201↑mmu-miR-143-3p0.451400018↓2.507247079↑

Note：↑.Fold change>1.5，up-regulated expression；↓.Fold change<0.5，down-regulated expression.

表3 清絡通痹方具有下調干預作用miRNA的變化倍數

Tab.3 Fold changes of miRNAs down-regulated by QLT

miRNAFoldchange(CIA/Normal)Foldchange(QLT/CIA)mmu-miR-295-5p1.791609005↑0.23593644↓mmu-miR-449a-3p2.628849627↑0.186170898↓mmu-miR-679-5p2.671667893↑0.426010122↓mcmv-miR-m01-12.106437656↑0.29378167↓mmu-miR-3109-5p2.910775869↑0.398391097↓mmu-miR-493-5p1.851070637↑0.346558879↓

Note：↑.Fold change>1.5，up-regulated expression；↓.Fold change<0.5，down-regulated expression.

圖1 RT-PCR與miRNA芯片結果比較Fig.1 Comparison of miRNA fold-changes by miRNA microarray and real-time PCR

圖2 QLT對miR-143相對表達水平的影響Fig.2 Effects of QLT on the expression of miR-143 by real time PCRNote: *.P<0.05 vs normal;#.P<0.05 vs CIA.

圖3 miR-143潛在作用靶標GO生物學過程富集分析Fig.3 Gene Ontology enrichment analysis of target genes of miR-143

2.4 mmu-miR-143生物信息學方法分析

2.4.1 mmu-miR-143的靶基因預測 利用軟件對所有靶基因分析，獲得microRNA-基因調控網絡，應用miRanda、TargetScan、miRRDB、miRWalk、RNA22預測 mmu-miR-143 的靶基因，取其三者交集的靶基因有1305個，其中結合文獻已證實的 mmu-miR-143靶標有：FNDC3B、 MAPK7、 MAPK3、KRAS、COX2、COL1A1、MMP-2、MMP-13、IL13、IL3ra1、Casp3、TNF、Akt1等118個。

2.4.2 mmu-miR-143預測靶基因的功能注釋GO分析 根據預測靶基因集合進行GO富集分析，發現有多個GO被miR-143調節，mmu-miR-143靶基因主要參與了離子轉運、蛋白質氨基酸磷酸化、骨骼系統發育、核糖核苷酸結合、ATP結合、細胞凋亡等生物過程(P<0.01)，如圖3。

2.4.3 mmu-miR-143預測靶基因信號轉導通路的富集分析 根據預測出的靶基因集合，采用DAVID數據庫對其進行基于 KEGG 數據庫的生物通路富集分析，發現mmu-miR-143參與了多個Pathway的調節，其靶基因顯著富集在血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、T細胞受體(T cell receptor)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase ,MAPK)、神經營養因子(Neurotrophin)、腫瘤等信號通路中(P<0.01)，如圖4。

圖4 miR-143潛在作用靶標信號轉導通路的富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of target genes of miR-143

3 討論

RA 是一種以關節滑膜組織慢性炎癥為特點的自身免疫性疾病，發病原因迄今尚不明確，其發生可能與遺傳、慢性炎癥、自身免疫功能紊亂等因素有關，miRNA的發現為RA的研究帶來了新的契機。MiRNA與靶基因結合后可介導 mRNA 降解或者抑制其翻譯，一個miRNA可調控生物體內多條基因的表達，進而參與細胞發育、分化、增殖、凋亡等生物學過程[5]。多種miRNA(如miR-23b、miR-146a、miR-155、miR-223、miR-203等)通過影響多種前炎癥因子的生成[6,7]，干預MAPK等信號分子的表達[6-8]，影響滑膜成纖維細胞增殖、遷移和破骨細胞分化與骨吸收過程[9]，miRNA調控網絡對RA的發展起著至關重要的作用[1]。本研究結果顯示：與空白對照小鼠比較，CIA小鼠具有差異表達的microRNA有221個，提示多種miRNA的異常表達參與CIA的病理過程。

miRNA芯片結果提示與CIA組比較QLT組差異表達的microRNA有169個，QLT可能有干預作用的有49個miRNAs。其中多種miRNA功能涉及生物體免疫、炎癥，細胞周期調控、細胞凋亡及分化等生理病理過程，亦可能參與RA的發展。如Stanczyk等[10,11]證實miRNA-203、miR-19a/b可通過核轉錄因子κB、調節Toll樣受體通路影響基質金屬蛋白酶(Matrix Metallo Preteinases，MMP)-1、MMP-3和IL-6的產生，miR-181調節T細胞的發育和成熟，影響單核細胞和巨噬細胞的炎癥反應等[12]，在RA滑膜炎癥發生和關節破壞方面發揮了重要作用。因此，QLT可能通過干預多種miRNA調控miRNA網絡，多環節、多途徑干預CIA的多種病理過程。

根據miRNA芯片結果結合文獻查閱，miR-143在腫瘤方面的研究顯示其可調控MMP-13、MMP-2、MMP-9等細胞因子[13，14]，Toll樣受體、MAPK/COX2 等信號分子[15,16]，進而影響細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成等過程。而在RA中多種細胞釋放IL、MMPs等細胞因子，并與VEGF、MAPK等多種信號蛋白交互作用，促進滑膜炎、血管翳與骨破壞的發生[17,18]。此外Tam等[19]發現 miR-143在傷害性感受刺激傳入的主要神經元上高表達，且CFA 炎性疼痛能夠引起 miR-143表達顯著下調，提示其可能與炎性疼痛相關。結合結果及文獻首先集中對miR-143進行驗證及分析，PCR結果顯示：CIA中miR-143下調為明顯，而QLT干預可上調miR-143的表達水平，提示miR-143可能是清絡通痹方調控 miRNA網絡的重要靶位之一。生物信息學分析發現miR-143 的靶基因中有VEGF、MAPKs、MMPs、TNF等，并參與了骨骼系統發育、蛋白質氨基酸磷酸化、離子轉運結合、細胞凋亡等生物過程；信號通路顯著富集在VEGF、T細胞受體、MAPK、神經營養因子信號通路等，均可能與RA炎癥、免疫、骨破壞等病理過程密切相關。QLT可能通過干預miR-143影響RA的免疫、炎癥、疼痛等多種病理過程。因此，miR-143可能作為復方治療RA的重要起始或中心環節，與多種細胞因子和信號蛋白相關，且具有網絡性調控的特點，因此可作為QLT復方機制研究的切入點。

綜上所述，多種miRNA的異常表達參與CIA的病理過程，QLT可能通過干預miRNA調控網絡，多環節、多途徑干預關節炎免疫、炎癥、疼痛等多種病理過程，miR-143可能作為QLT治療RA的重要環節。本研究為進一步認識QLT干預膠原性關節炎機制提供新的線索，有助于深化對RA病理機制、治療策略的認識。

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[收稿2015-07-24]

(編輯 許四平)

Study of Qingluo Tongbi Compound treating rheumatoid arthritis based on miRNA network

ZHU Ya-Mei，ZHOU Ling-Ling，PENG Xiao-Wu，GENG Shan，ZHOU Xue-Ping.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China

Objective:To study the mechanism of Qingluo Tongbi Compound(QLT) treating rheumatoid arthritis(RA)by observing miRNA Network of QLT on collagen-induced arthritis(CIA) mice.Methods: The model of RA was induced by collagenⅡ in DBA/1 mice and randomly divided into control group,CIA group,QLT group.Differently expressed miRNAs were detected by miRCURYTM LNA Array.Real-time PCR was applied to verify the reliability of miRNA array.Results: The bioinformatics software and database were applied to predict and analyze target genes.MiRNA array results showed that 221 miRNAs changed in CIA group compared with the control group,and 169 miRNAs changed in QLT group compared with CIA group.And the results of real-time PCR were consistent with the array.Compared with the control group,miR-143 was significantly reduced in CIA group,intervention of QLT obviously upregulated the expression of miR-143.The target genes of miR-143 were significantly stored in VEGF,T cell receptor,MAPK,signaling pathway.Conclusion: Multiple abnormal expression of miRNAs involved in the pathological process of CIA.QLT affected the expression of various miRNAs,which might be related to immunity,inflammation,pain pathological process of RA and miR-143 could be a potential target in the treatment.

microRNA;CIA;Qingluo Tongbi Compound(QLT)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.010

①本文受國家自然基金項目(81573869)、2014江蘇省普通高校研究生科研創新計劃(SJZZ-0122)資助和南京中醫藥大學國自然預研基金項目(14XYY01、14XYY10)。

朱亞梅(1989年-)，女，在讀博士，主要從事中醫內科學(風濕病)研究，E-mail: zym-1220@163.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)04-0495-05

②通訊作者，E-mail：zxp@njutcm.edu.cn。