IRF3基因干擾對LPS刺激原代枯否細胞早期細胞因子分泌動態變化的影響①

朱 彤 涂文娟 談志麗 劉亮明

(南京醫科大學附屬上海松江中心醫院/上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院感染科，上海201600)

?

IRF3基因干擾對LPS刺激原代枯否細胞早期細胞因子分泌動態變化的影響①

朱 彤 涂文娟 談志麗 劉亮明

(南京醫科大學附屬上海松江中心醫院/上海交通大學附屬第一人民醫院松江分院感染科，上海201600)

目的：探討干擾素調節因子3(Interferon regulator factor 3，IRF3)shRNA腺病毒對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激枯否細胞(Kupffer cell，KC)早期細胞因子分泌動態變化的影響。方法：采用在體灌注分離培養大鼠原代KC，以IRF3 shRNA腺病毒體外感染KC，48 h后采用LPS刺激細胞，于0、2、4和6 h收集細胞培養上清液，并收集6 h細胞。上清液細胞因子的分泌采用ELISA分析；細胞IRF3基因表達采用RT-PCR和Western blot方法檢測。結果：LPS刺激誘導了KC內IRF3 mRNA和蛋白質表達升高，IRF3 shRNA腺病毒的應用抑制了LPS刺激誘導和非刺激組成性IRF3 mRNA和蛋白質的表達；KC受LPS刺激活化后極早期(2 h)IFN-β分泌即上升，4 h達峰值，6 h分泌水平開始下降，但仍維持于高水平。干擾腺病毒的應用抑制了LPS刺激后各時間點IFN-β的分泌，抑制分泌高峰的出現，并使6 h分泌水平趨于正常；KC活化后極早期即分泌大量TNF-α，并于2 h內達到峰值，隨后分泌逐漸下降，但6 h仍維持于高水平。干擾腺病毒的應用抑制了LPS刺激各時間點TNF-α的分泌，并抑制了分泌高峰的出現；IL-1β分泌增高出現于LPS刺激4 h后，6 h分泌水平達更高值。干擾腺病毒的應用抑制了LPS刺激早期KC對IL-1β的分泌；KC受LPS刺激活化后極早期IL-10分泌即上升，且隨著LPS刺激時間延長，其分泌水平逐漸增加。IRF3 shRNA腺病毒的應用促進了LPS刺激后早期各時間點IL-10的分泌。結論：IRF3 shRNA腺病毒可使原代枯否細胞IRF3基因表達沉默；在LPS刺激原代KC，IRF3可促進其下游信號分子IFN-β、前炎細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，并抑制抑炎細胞因子IL-10分泌。因此，IRF3可能在肝組織免疫炎癥性損傷的發生中起中心作用。

原代枯否細胞；干擾素調節因子3；基因干擾；固有免疫；炎性反應

枯否細胞(Kupffer cell，KC)是肝臟常駐的組織巨噬細胞，是肝臟針對來自腸道和/或血循環中病原微生物及其釋放的毒性代謝產物的第一道防線，是機體固有免疫應答的重要成分。病原微生物或其毒性產物可激活KC，誘導其表達和釋放多種炎性細胞因子，造成肝組織急性損傷性炎癥[1]。已知KC活化后的炎性釋放效應主要是由TLR4信號通路激活所介導的[2，3]。LPS等炎性刺激物，可結合并激活KC表面TLR4分子，進而誘導其下游接頭蛋白MyD88和TRIF信號活化[1，2]。MyD88信號可通過激活NF-κB，誘導前炎細胞因子TNF-α、IL-1β等的表達和釋放，引起組織炎性損傷；TRIF信號(或MyD88非依賴信號)可通過激活IRF3，誘導Ⅰ型干擾素的產生[1]。已證實，IRF3-IFN-β是KC發揮固有免疫應答的關鍵信號分子通路[1]。在病原微生物感染期間，轉錄因子IRF3在巨噬細胞內的升高程度與機體對病原微生物的固有免疫應答水平呈密切的正相關關系[4]。

傳統認為，IRF3和NF-κB是兩條獨立并互不影響的信號分子通路。但是，近年發現，IRF3在組織炎癥反應中也起重要的作用[5，6]。我們前期研究也證實，在肝組織炎癥損傷期間，肝內IRF3的表達顯著升高[7]。為進一步探討IRF3對肝組織炎癥反應的影響機制，在本項目中，我們采用IRF3基因沉默實驗，研究了IRF3信號對KC活化后早期前炎細胞因子TNF-α和IL-1β以及抑炎性細胞因子IL-10分泌水平動態變化的影響。因為固有免疫細胞的炎性釋放是組織炎癥反應發生的一個早期事件。項目研究的完成，有助于闡明IRF3對KC炎癥信號通路的影響，為將來探討IRF3在急性肝衰竭發生中的免疫炎癥效應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性健康SD大鼠，體重250 g，由上海交通大學附屬第一人民醫院實驗動物中心提供。動物合格證號：SYXK(滬)2009-0086。動物飼養環境溫度：20℃～23℃。濕度：40%～80%。所有大鼠均自由飲水和進食。每12 h開燈或關燈。實驗前禁食12 h。實驗動物的使用符合國家動物保護法。

1.1.2 主要試劑與耗材 IV型膠原酶和Trizol購自美國Invitrogen公司；1640培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自德國Hyclone公司；Percoll細胞分離液購自瑞典Pharmacia公司；LPS購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購自美國Thermo公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成； ELISA試劑盒購自美國Ebioscience公司；IRF3兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；Western blot試劑購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 原代枯否細胞的分離與培養 采用文獻[8]方法分離培養大鼠原代KC。操作方法簡述如下：0.2%戊巴比妥鈉以25 ml/kg腹腔注射麻醉，0.1%的肝素1 ml腹腔注射。75%酒精消毒大鼠后，行開腹門靜脈插管，予PBS灌注沖洗肝臟，推注0.05% Ⅳ膠原酶行原位在體灌注消化肝組織。隨后剪取肝臟置于Ⅳ型膠原酶消化液中，小心撕碎肝組織。用不連續Percoll密度梯度離心分離枯否細胞，分離出來的枯否細胞以1640培養液(胎牛血清10%、青霉素1 000 U/L、鏈霉素1 000 U/L)、37℃、5%CO2培養箱培養3～4 h后，洗去未貼壁細胞即可獲得純化的枯否細胞?？莘窦毎b定采用墨汁吞噬試驗和ED2染色，方法見參考文獻[8]。細胞活性在90%以上時用于下一步實驗研究。

1.2.2 腺病毒感染原代枯否細胞方法 IRF3 shRNA綠色熒光蛋白(GFP)表達腺病毒由本實驗室設計合成，并經抑制效率研究，選取抑制效率最好者(針對基因位點1219～1239：5′-GGTTGTTCCTACATGTCTTAA-3′)進行實驗。該干擾腺病毒采用了pAdeno-U6-CMV-EGFP質粒攜帶，并經與腺病毒骨架質粒pBHGlox E1E3重組包裝構建。其中的綠色熒光蛋白(GFP)基因可方便病毒感染效率的觀察。腺病毒感染原代枯否細胞的具體方法：細胞接種于6孔板，每孔細胞數4×106個。細胞培養24 h待其穩定貼壁后，吸棄培養上清液。每孔細胞中加入500 μl含腺病毒MOI為150的無血清的培養液，置于37℃、5%CO2培養箱培養2 h。棄上清，換成含5%血清的培養液，繼續培養46 h。

1.2.3 細胞的處置 干擾腺病毒感染細胞48 h后，按照文獻[9,10]，以終濃度為20 μg/ml的LPS刺激細胞。在LPS刺激細胞0、2、4和6 h后，分別收集細胞培養上清液并收集刺激6 h細胞用于后續實驗。

1.2.4 RT-PCR檢測 肝枯否細胞采用Trizol處理，總RNA抽提按說明書進行。以總RNA作為模板用于第一鏈cDNA的合成。引物設計借助Primer Premier 6軟件設計，基因檢測引物序列和產物長度見表1。操作方法按試劑盒說明書進行。反應體系：4.0 μl cDNA模板，2 μl 10×PCR緩沖液，4 μl dNTP混合物，2 μl TaqDNA聚合酶，上、下游引物各2 μl，補充無核酶水至25 μl, 置于PCR儀中進行聚合擴增。IRF3基因反應條件為: 94℃預變性5 min，94℃ 1 min，51℃ 45 s，72℃ 45 s，共32個循環; 72℃延伸10 min。所得PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內參照。電泳結果經Bio-Rad Quantity-One 4.7成像分析軟件檢測，并計算待測基因灰度相對GAPDH的表達量。

1.2.5 細胞總蛋白抽提 細胞總蛋白提取按照試劑盒說明書操作。簡要步驟如下：用PBS洗細胞后，加入100 μl裂解液。用槍吹打數下，使裂解液與細胞充分接觸。待細胞充分裂解后，10 343 r/min離心5 min，取上清即為所需的細胞總蛋白。蛋白濃度的測定按照碧云天蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，水浴煮沸，-70℃保存備用。

1.2.6 免疫印跡(Western blot) 每個樣本取40 μg蛋白，進行8%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，將蛋白轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h。封閉結束后，用IRF3抗體和內參β-actin在4℃下孵育過夜。0.1%PBST漂洗3次，每次10 min。加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h。0.1%PBST漂洗3次，每次10 min。結果用ECL-Plus化學發光試劑盒檢測，X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結果。結果用Image J軟件讀取灰度值。

表1 基因擴增引物序列和產物長度

Tab.1 Primer sequences and product length of gene amplification

GenePrimersequence5'→3'ProductlengthIRF3Sense:ACGCACAGATGGCTGACTTT102bpAnti-sense:TCCTCTTCCAGGTTGACAGGGAPDHSense:GACATGCCGCCTGGAGAAAC92bpAnti-sense:GACATGCCGCCTGGAGAAAC

1.2.7 酶聯免疫技術(ELISA) 細胞上清液采用雙抗體夾心酶聯免疫技術檢測不同時間點的TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-10，操作過程按照試劑盒說明書進行。每份標本取3復孔，結果取三者均值。實驗重復進行6次。

2 結果

2.1IRF3shRNA腺病毒感染原代大鼠KC鏡下表現 原代KC培養24h后細胞完全舒展，大小基本一致，但形態不規則，可呈星形、多角形等(見圖1A)。KC常規培養24h穩定貼壁后，感染IRF3shRNA腺病毒。圖1B為感染腺病毒48h后，KC在熒光倒置顯微鏡下的表現。鏡下可見KC內表達的GFP。通過觀察細胞內GFP的表達情況，可了解IRF3shRNA腺病毒對KC的感染效率(經計算，腺病毒的細胞感染效率接近100%)。

2.2IRF3shRNA腺病毒對枯否細胞IRF3mRNA表達的影響 原代枯否細胞IRF3mRNA表達的凝膠電泳圖及其相對表達水平直方圖如圖2。經統計學處理，LPS刺激細胞IRF3mRNA的相對表達水平較正常對照組細胞升高[(1.43±0.03)比(1.03±0.03)，P<0.05]，而干擾腺病毒預處理后，使LPS刺激細胞IRF3mRNA的相對表達水平降低[(0.72±0.07)vs(1.43±0.03)，P<0.05]。另外，與正常對照組相比，單獨應用干擾腺病毒處理細胞IRF3mRNA的相對表達水平降低[(0.69±0.07)vs(1.03±0.03)，P<0.05]。這提示，IRF3shRNA腺病毒對原代枯否細胞LPS刺激誘導IRF3mRNA的高表達和非刺激性IRF3mRNA的組成性表達均有抑制性影響。

圖1 原代KC 腺病毒感染前后鏡下表現 Fig.1 Optical microscopic manifestation of primary KC before and after affected by adenovirusNote: A.Optical microscopic manifestation(×200)of primary KC before affected by adenovirus；B.Inversed fluorescent microscopic manifestation(×200)of primary KC after affected by adenovirus.

2.3IRF3shRNA腺病毒對枯否細胞IRF3蛋白表達的影響 枯否細胞內IRF3蛋白免疫印跡圖及其蛋白質相對表達水平見圖3。經統計學處理，LPS刺激細胞內IRF3蛋白質的水平較正常對照組升高[(1.32±0.10)vs(1.01±0.13)，P<0.05]，而干擾腺病毒預處理后，LPS刺激細胞IRF3蛋白的表達水平降低[(0.58±0.13)vs(1.32±0.10)，P<0.05]。另外，與正常對照組細胞比較，單獨應用干擾腺病毒組細胞IRF3蛋白的水平降低[(0.61±0.03)比(1.01±0.13)，P<0.05]。這提示，LPS可刺激誘導KC胞內IRF3蛋白表達升高，IRF3shRNA腺病毒對原代枯否細胞LPS刺激誘導IRF3蛋白的超高表達和非刺激性IRF3蛋白的組成性表達均有抑制性影響。

圖2 原代枯否細胞IRF3 mRNA表達情況(RT-PCR)Fig.2 Expression of IRF3 mRNA in primary KCs(RT-PCR)Note: A.Representative ethidium bromide-stained gel of RT-PCR products.Lane 1.IRF3 shRNA(-)LPS(-);Lane 2.IRF3 shRNA(-)LPS(+);Lane 3.IRF3 shRNA(+)LPS(-);Lane 4.IRF3 shRNA(+)LPS(+);M.DL2000 DNA marker；B.Statistical bar graph of relative expression of IRF3 mRNA in KCs.*.P<0.05 vs shRNA(-)LPS(-);#.P<0.05 vs IRF3 shRNA(-)LPS(+).

圖3 原代枯否細胞IRF3蛋白表達情況(Western blot) Fig.3 Expression of IRF3 protein(Western blot)Note: A.Western blot;B.Statistical bar graph of expression of IRF3 protein.Lane 1.IRF3 shRNA(-)LPS(-);Lane 2.IRF3 shRNA(-)LPS(+);Lane 3.IRF3 shRNA(+)LPS(-);Lane 4.IRF3 shRNA(+)LPS(+).*.P<0.05 vs shRNA(-)LPS(-);#.P<0.05 vs IRF3 shRNA(-)LPS(+).

2.4IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IFN-β早期分泌的動態影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IFN-β早期分泌的動態影響見圖4A。經統計學處理，單獨應用LPS處理原代枯否細胞IFN-β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4、6h時間點均較0h升高[(35.57±2.23)、(43.04±2.00)、(26.31±7.82)vs(17.09±1.84)pg/ml，均P<0.05]，4h時間點較2h和6h增高(均P<0.05)；干擾腺病毒預處理原代枯否細胞IFN-β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2h和4h時間點較0h和6h均增高[(24.73±2.68)、(25.77±5.26)vs(17.27±1.27)和(17.15±1.14)pg/ml，均P<0.05)]，4h與2h時間點之間以及6h與0h時間點之間IFN-β蛋白水平無明顯統計學差異(均P>0.05)。另外，干擾腺病毒預處理細胞在LPS刺激后2、4、6h各時間點IFN-β蛋白的分泌水平均較單獨應用LPS處理細胞低(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導KC分泌IFN-β，4h達分泌峰值，6h分泌水平開始下降，但仍維持于高水平；IRF3shRNA腺病毒可抑制LPS刺激后各時間點IFN-β的分泌，抑制分泌高峰的出現，并使6h分泌水平正常。

圖4 原代枯否細胞培養上清液IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白分泌水平(ELISA分析)Fig.4 Secretion levels of IFN-β，TNF-α，IL-1β and IL-10 protein in culture supernatant of primary KCs(ELISA assay)Note: A.Secretion levels of IFN-β protein;B.Secretion levels of TNF-α protein;C.Secretion levels of IL-1β protein;D.Secretion levels of IL-10 protein.*. P<0.05 vs 0 h;#.P<0.05 vs 2 h;△.P<0.05 vs 4 h;▼.<0.05 vs LPS.

2.5IRF3shRNA對LPS刺激枯否細胞TNF-α早期分泌的動態影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞TNF-α早期分泌的動態影響見圖4B。經統計學處理，單獨應用LPS處理原代枯否細胞TNF-α蛋白分泌水平在LPS刺激后2、4、6h時間點均較0h升高[(445.52±49.08)、(348.96±13.08)、(288.80±27.74)vs(76.85±20.19)pg/ml，均P<0.05]，同時2h時間點較4h和6h高(P<0.05)，4h較6h高(P<0.05)；干擾腺病毒預處理原代枯否細胞TNF-α蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4和6h時間點較0h升高[(234.39±40.04)、(208.15±85.62)、(179.27±13.37)vs(69.99±17.33)pg/ml，均P<0.05]，2、4和6h時間點之間比較無明顯統計學差異(均P>0.05)。另外，干擾腺病毒預處理細胞在LPS刺激后2、4 、6h各時間點TNF-α蛋白的分泌水平均較單獨應用LPS處理細胞低(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導KC大量分泌TNF-α并達峰值，隨后分泌逐漸下降，但6h仍維持于高水平；IRF3shRNA腺病毒可抑制LPS刺激后早期各時間點TNF-α的分泌，并抑制了分泌高峰的出現。

2.6IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IL-1β早期分泌的動態影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IL-1β早期分泌的動態影響見圖4C。經統計學處理，單獨應用LPS處理原代枯否細胞IL-1β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后4h和6h時間點均較0h和2h明顯升高[(173.35±20.23)、(560.73±89.26)vs(50.03±4.90)、(52.90±1.91)pg/ml，均P<0.05]，6h時間點較4h高(P<0.05)，0h與2h之間比較無明顯統計學差異(P>0.05)；干擾腺病毒預處理原代枯否細胞IL-1β蛋白分泌水平，在LPS刺激后4h和6h時間點較0h和2h升高[(87.73±27.34)、(330.42±97.27)比(48.35±4.10)、(50.57±3.28)pg/ml，均P<0.05]，6h較4h增高(均P<0.05)，0h和2h之間比較無明顯統計學差異(P>0.05)。另外，干擾腺病毒預處理細胞在LPS刺激后IL-1β水平均較單獨應用LPS處理細胞4h和6h時間點分泌降低(均P<0.05)，2h和0h時間點比較無明顯統計學差異(P>0.05)。這提示，LPS刺激后極早期，IL-1β的分泌無明顯增加，直到4h后才開始上升，6h分泌達峰值；IRF3shRNA腺病毒抑制了LPS刺激后早期KC對IL-1β的分泌。

2.7IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IL-10早期分泌的動態影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細胞IL-10早期分泌的動態影響見圖4D。經統計學處理，單獨應用LPS處理原代枯否細胞IL-10蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4、6h時間點均較0h升高[(28.32±7.79)、(47.55±15.36)、(149.29±27.06)vs(18.89±3.53)pg/ml，均P<0.05]，6h時間點較2h和4h均高(均P<0.05)；干擾腺病毒預處理原代枯否細胞IL-10蛋白分泌水平，在LPS刺激2、4和6h時間較0h均升高[(39.05±3.09)、(180.20±35.48)、(621.38±178.99)vs(22.10±1.78)pg/ml，均P<0.05]，6h較2h和4h高(均P<0.05)。另外，干擾型病毒預處理細胞在LPS刺激后2、4和6h各時間點IL-10蛋白分泌水平均較單獨應用LPS處理細胞高(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導KC分泌IL-10，且在早期階段呈現進行性分泌增加；IRF3shRNA腺病毒的應用促進了LPS刺激后早期各時間點IL-10的分泌。

3 討論

我們前期研究證實，急性肝衰竭肝內IRF3的表達升高，阻斷炎癥相關信號系統UII/UT信號傳導，可抑制IRF3的表達和活化，并能減輕肝組織免疫炎癥性損傷[7，11，12]。這提示IRF3可能對肝組織炎癥反應有影響。為探討IRF3在肝內的免疫炎性效應，我們在本項目中采用了LPS刺激原代KC實驗。我們首先對KC內IRF3的表達進行了研究。我們發現，LPS刺激可誘導KC對IRF3mRNA和蛋白質表達上調。在此基礎上，我們研究了IRF3-IFN-β信號與炎癥相關因子分泌之間的關系。

已知，在組織炎癥反應中，固有免疫細胞對前炎細胞因子的分泌是一個早期事件。損傷性刺激在極早期誘導的肝內TNF-α大量分泌，并進而誘導IL-1β等細胞因子的級聯式釋放，是造成急性肝組織損傷性炎癥反應的關鍵因素[13]。因此，在本實驗中，我們研究了LPS刺激早期，KC對細胞因子的分泌及其動態變化情況。我們發現，LPS刺激KC后，IRF3下游細胞因子IFN-β分泌在極早期(2h)即開始上升，4h達分泌峰值，而TNF-α的分泌水平在刺激2h內即達峰值，隨后逐漸下降；IL-1β分泌則直到4h后才開始上升，6h分泌達峰值；IL-10分泌于2h開始逐漸上升，至6h達到峰值。上述細胞因子的這種時間依賴性分泌的動態變化規律，使我們至少可以得到以下三個方面的提示：①IRF3下游信號分子IFN-β可能不是TNF-α早期分泌的促發因素。因為KC對IFN-β的分泌晚于TNF-α，特別是其分泌高峰出現于TNF-α峰值之后；②TNF-α可能是免疫炎癥反應的始動因素。我們的實驗顯示，除IFN-β外，IL-1β的分泌也晚于TNF-α。已證實，巨噬細胞活化后，TNF-α的早期爆式分泌，是隨后IL-1β等前炎細胞因子級聯式釋放的前提，決定了炎癥反應的發生和發展[14]。TNF-α對枯否細胞IFN-β的表達與分泌是否存在影響目前尚不十分清楚。近年有文章顯示，TNF-α可誘導腫瘤細胞IFN-β表達上調[15]。這提示TNF-α可能也存在固有免疫應答效應；③抑炎細胞因子IL-10分泌增加可能是細胞自身的一種負反饋調控機制。我們發現，在炎性激活早期，KC對IL-10的分泌是緊隨TNF-α和IFN-β分泌之后逐漸升高的。這時炎性釋放和炎癥反應已開始啟動，并隨時間呈進行性或級聯式增強，IL-10分泌水平的逐漸增加可能有助于防止過度的炎癥和免疫反應。

為進一步探討IRF3對炎癥相關因子的影響，我們對KC進行了IRF3基因干擾實驗。我們的研究顯示，IRF3shRNA腺病毒感染KC后，LPS刺激誘導的IRF3mRNA和蛋白質超高表達及非刺激狀態下細胞對IRF3mRNA和蛋白質的組成性表達均下調，且明顯抑制了LPS誘導的IRF3下游信號分子IFN-β在炎性激活早期各個時間點的分泌水平，抑制了分泌高峰的出現，并使其6h的水平趨于正常。這提示，我們所構建的干擾腺病毒能有效地使IRF3 基因表達沉默，并阻斷其信號通路的傳導。此外，我們的結果還顯示，干擾腺病毒抑制了KC在炎性激活早期各時間點TNF-α分泌及隨后的IL-1β分泌，特別是抑制了極早期(2h)TNF-α的分泌峰值。這表明，IRF3存在炎性分泌促進效應。然而，IRF3促進TNF-α等前炎細胞因子分泌的機制目前并未完全清楚。在KC炎性激活早期，TNF-α早于IFN-β分泌，因而TNF-α分泌不依賴于IRF3下游信號分子IFN-β。報告顯示，IRF3對NF-κB不存在直接作用[16]。最近研究發現，LPS刺激后，IRF3基因敲除巨噬細胞對TNF-α的分泌明顯減少，但細胞內TNF-αmRNA的水平未受影響[17]。因此，IRF3對TNF-α的調控可能主要發生在轉錄后。

我們也研究了IRF3shRNA腺病毒對細胞因子IL-10分泌水平的影響。我們發現，干擾腺病毒的應用促進了LPS刺激KC早期各時間點IL-10的分泌。這表明，IRF3對IL-10的分泌存在抑制效應。已知，IL-10是一種具有免疫調控效應的抗炎性細胞因子(anti-inflammatorycytokine)。IL-10可通過誘導SOCS3的表達，抑制LPS刺激巨噬細胞對TNF-α、IL-6和iNOS的表達[18]。最近報告顯示，IL-10可降解NF-κBp65亞基并誘導MAPK磷酸酶使MAPK信號失活[19]。此外，IL-10還可抑制巨噬細胞激活，抑制固有免疫細胞針對病原體的免疫應答[20]。因此，IL-10可能是TLR4免疫炎癥信號傳導的負性調控分子。在損傷刺激期間，IRF3對LPS誘導IL-10超高表達的抑制效應，有助于增強細胞的固有免疫應答和組織炎癥反應。

本項目的研究從一個側面對急性肝衰竭發生的炎癥和免疫機制相統一的分子基礎進行了探討?？莘窦毎鳛楦蝺戎饕墓逃忻庖呒毎粌H發揮著針對外源物質的固有免疫應答效應，而且也是肝內炎性釋放的主要來源。而上述免疫和炎癥效應的產生都有一個統一的分子基礎，那就是IRF3。IRF3通過對其下游信號分子IFN-β、前炎細胞因子TNF-α和IL-1β分泌的促進效應以及對抑炎細胞因子IL-10分泌的抑制效應，可能在急性肝衰竭肝組織免疫炎癥損傷的發生中起中心作用。項目成果對于將來急性肝衰竭內科治療藥物關鍵分子靶點的選擇有重要價值。

[1] Tsutsui H,Nishiguchi S.Importance of Kupffer cells in the development of acute liver injuries in mice[J].Int J Mol Sci,2014,15(5):7711-7730.

[2] Jeong E,Lee J Y.Intrinsic and extrinsic regulation of innate immune receptors[J].Yonsei Med J,2011,52:379-392.

[3] 涂文娟，汪小庭，劉亮明，等.UII/UT系統對LPS刺激枯否細胞固有免疫炎癥信號通路TLR4-IRF3的影響[J].中國免疫學雜志，2014,30(10)：1313-1319.

[4] Rustagi A,Gale Jr M.Innate antiviral immune signaling,viral evasion and modulation by HIV-1[J].J Mol Biol,2014,426:1161-1177.

[5] Di Paolo NC,Doronin K,Baldwin LK,etal.The transcription factor IRF3 triggers "defensive suicide" necrosis in response to viral and bacterial pathogens[J].Cell Rep,2013,3:1840-1846.

[6] Shaik-Dasthagirisaheb YB,Huang N,Gibson FC 3rd.Inflammatory response to Porphyromonas gingivalis partially requires interferon regulatory factor(IRF)3[J].Innate Immun,2014,20:312-319.

[7] 汪小庭，涂文娟，劉亮明，等.Urantide對急性肝衰竭小鼠肝組織中IRF3表達的影響[J].世界華人消化雜志，2014，22(18)：2559-2564.

[8] 葉長根，梁冬雨，趙亮，于芳萍，孫水林，張吉翔，劉亮明.大鼠枯否細胞的分離、鑒定以及LPS刺激誘導TNF-α的表達[J].世界華人消化雜志，2013，21(4):307-312.

[9] Liu LM,Liang DY,Ye CG,etal.The UII/UT system mediates upregulation of proinflammatory cytokines through p38 MAPK and NF-κB pathways in LPS-stimulated Kupffer cells[J].PLoS One,2015,10(3):e0121383.[10] Liu LM,Zhao L,Liang DY,etal.Effects of urotensin-Ⅱ on cytokines in early acute liver failure in mice[J].World J Gastroenterol,2015,21(11):3239-3244.

[11] Liang DY,Liu LM,Ye CG,etal.Inhibition of UII/UTR system relieves acute inflammation of liver through preventing activation of NF-κB pathway in ALF mice[J].PloS One,2013,8(6):e64895.

[12] 祝娟娟，程明亮，趙雪珂.肝臟免疫炎癥在非酒精性脂肪肝病發生發展中的作用[J].臨床肝膽病雜志，2016，32(3)：570-573.

[13] Liu D,Li C,Chen Y,etal.Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide[J].J Biol Chem，2004,279:48434-48442.

[14] Parameswaran N,Patial S.Tumor necrosis factor-α signaling in macrophages[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2010,20(2):87-103.

[15] Chairatvit K,Wongnoppavich A,Choonate S.Up-regulation of interferon-stimulated gene 15 and its conjugates by tumor necrosis-α via type I interferon-dependent and-independent pathways[J].Mol Cell Biochem,2012,368:195-201.

[16] Covert MW,Leung TH,Gaston JE,etal.Achieving stability of lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation[J].Science,2005,309(5742):1854-1857.

[17] Siegfried A,Berchtold S,Manncke B,etal.IFIT2 is an effector protein of type I IFN-mediated amplification of lipopolysaccharide(LPS)-induced TNF-α secretion and LPS-induced endotoxin shock[J].J Immunol,2013,191(7):3913-3921.

[18] Berlato C,Cassatella MA,Kinjyo I,etal.Involvement of suppressor of cytokine signaling-3 as a mediator of the inhibitory effects of IL-10 on lipopolysaccharide-induced macrophage activation[J].J Immunol,2002,168:6404-6411.

[19] Kwilasz AJ,Grace PM,Serbedzija P,etal.The therapeutic potential of interleukin-10 in neuroimmune diseases[J].Neuropharmacology,2014,4:1-15.

[20] Krause P,Morris V,Greenbaum JA,etal.IL-10-producing intestinal macrophages prevent excessive antibacterial innate immunity by limiting IL-23 synthesis[J].Nat Commun,2015,6:7055

[收稿2015-08-01]

(編輯 張曉舟)

Effects of IRF3 gene interference on dynamic changes of cytokine secretions in early of LPS stimulation in primary Kupffer cells

ZHU Tong，TU Wen-Juan,TAN Zhi-Li,LIU Liang-Ming.Department of Infection,Songjiang Hospital Affiliated to First People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai Songjiang Central Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Shanghai 201600,China

Objective:To investigate the effects of IRF3 shRNA adenovirus on dynamic changes of early cytokines in LPS-stimulated primary Kupffer cells(KCs).Methods: Rat KCs were isolated and purified by means of in situ perfusion.After being infected with adenovirus carrying IRF3 shRNA for 48 h,KCs were stimulated with LPS.Cell culture supernatants were collected respectively at 0,2,4 and 6 h after LPS stimulation as well as cells at 6 h.Supernatant cytokine secretion levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Intracellular gene expressions were tested by RT-PCR and Westeron blot.Results: IRF3 mRNA and protein were induced by LPS,but suppressed by IRF3 shRNA adenovirus in LPS-stimulated or non-stimulated KCs.IFN-β secretions rose in the very early stage(at 2 h),reached the peak at 4 h,and began to reduce but still remained high levels at 6 h after LPS stimulation in KCs.Interference adenovirus pretreatment suppressed IFN-β secretions(especially the secretion peak)at each time point after LPS stimulation.IFN-β secretions reached normal levels at 6 h after the stimulation in adenovirus-pretreated cells;TNF-α secretions rapidly increased in the very early stage and reached the peak at 2 h,then began to decrease gradually,but remained high levels at 6 h after LPS stimulation in KCs.Interference adenovirus pretreatment inhibited LPS-induced TNF-α secretions,especially the secretion peak;IL-1β secretions did not increase untill 4 h,but reached a higher level at 6 h after LPS stimulation.Interference adenovirus suppressed IL-1β secretions in the early stage of LPS stimulation;IL-10 secretions began to rise in the very early stage,and gradually increased over time after LPS stimulation in KCs.Pretreatment of adenovirus with IRF3 shRNA promoted upregulations of IL-10 secretions at each time point of the early of LPS stimulation.Conclusion: IRF3 gene expression can be silenced by IRF3 shRNA adenovirus.IRF3 can promote its downstream signaling molecule IFN-β and pro-inflammatory cytokines including TNF-α and IL-1β,and block anti-inflammation cytokine IL-10 secretions in LPS-stimulated primary KCs.Therefore,IRF3 may play a central role in immune inflammatory injury of liver tissues.

Primary kupffer cells;IRF3;Gene interference;Innate immune;Inflammatory reaction

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.004

①本文為國家自然科學基金項目(81070357, 30660066)和上海市松江區科學技術攻關項目(14SJGGYY22)。

朱 彤(1990年-)，女，主要從事重癥肝病免疫機制研究，E-mail:zhutong1990@foxmail.com。

及指導教師：劉亮明(1968年-)，男，醫學博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事肝臟病基礎和臨床研究，E-mail: liuliangming@hotmail.com。

R575.3

A

1000-484X(2016)04-0470-07