新生兒退黃中藥洗液對溶血性黃疸大鼠模型的實驗研究

王艷寧　朱世龍　吳曙粵

【摘 要】 目的：分析新生兒退黃中藥洗液對乙酰苯肼（APH）所致大鼠溶血性貧血模型的退黃作用。方法：50只大鼠隨機分為正常組（10只）和APH處理組（40只）。將APH 150 mg/kg腹腔注射大鼠，48h后經APH處理的大鼠隨機分為陽性對照組及新生兒退黃中藥洗液高、中、低劑量組（藥液分別稀釋5、10、50倍），每組10只。正常組、陽性對照組大鼠每天給予自來水泡浴，洗液組予洗液泡浴15min，連續3 d。泡浴結束后摘眼球取血測定大鼠血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽汁酸（TBA）；并觀察大鼠心肝肺腎的生理形態。結果：APH處理組大鼠肝功能受損，肝臟組織切片示肝血竇有擴張、充血及肝總管內鐵血黃素淤積、膽紅素淤積的程度較正常組高，心肺腎組織無明顯變化；血清肝功能各項指標較正常組明顯升高（P<001）。各濃度退黃外洗液組與陽性對照組比較，血清肝功能指標均下降并有統計學差異（P<005），但組間比較無統計學差異（P>005）。結論：新生兒退黃中藥洗液對APH所致的大鼠溶血性黃疸均有退黃、降酶作用，各濃度組效果相當，且對心肝肺腎無組織損害。

【關鍵詞】 新生兒退黃中藥洗液；乙酰苯肼；大鼠；溶血性黃疸模型

【中圖分類號】R2855 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）20-0006-03

新生兒退黃中藥洗液來源于我院吳曙粵主任醫師多年臨床經驗方，該方主要成分為茵陳、大黃、山梔子、柴胡等15味中藥組成，有利膽、消炎、保肝、退黃作用[1]，并獲國家發明專利（專利號：Zl2005100195621）。臨床上泡浴用于新生兒黃疸患兒，取得了良好效果[2]，研究以乙酰苯肼（APH）腹腔注射大鼠制成溶血性黃疸模型，通過檢測經新生兒退黃中藥洗液泡浴后溶血性黃疸大鼠的血清肝功能的相關指標血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽汁酸（TBA）的水平并觀察心肝肺腎等組織的病理變化，探討洗液對溶血性黃疸大鼠的退黃利膽作用。

1 儀器與材料

11 動物 健康SD大鼠50只，雌雄不分，體質量（200±20）g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK桂2009-0002，廣西醫科大學動物實驗中心恒溫飼養，自由飲水并喂標準顆粒飼料。

12 藥物 新生兒退黃中藥洗液（自制，登記號為20120412，250mL/瓶），分別將新生兒退黃中藥洗液原液（生藥量為3g/mL）稀釋為5倍、10倍、50倍，制成高、中、低濃度洗液，即濃度分別為600mg/mL、300mg/mL、60mg/mL。

13 儀器 日立7600全自動生化分析儀；DT5-3離心機（北京時代北利離心機有限公司）；JY5002電子天平（上海志榮電子科技有限公司）；Excelsior ES型自動脫水機、Finesse325切片機（英國珊頓公司）； YB-6LF冷凍包埋機、YR-14染色機（湖北亞光公司）； BA400型光學顯微鏡（中國Motio公司）。

14 試劑 乙酰苯肼（批號：120929，天津市大茂化學試劑廠）；總膽紅素測定試劑盒-TBIL（批號：17066）、直接膽紅素測定試劑盒-DBIL（批號：16932）、丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒-ALT（批號：27031）、天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒AST（批號：26026）、總膽汁酸測定試劑盒-TBA（批號：10089）均購自德國DiaSys公司。

2 方法

21 動物分組與造模 50只SD大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為正常組（10只）和乙酰苯肼處理組（40只）。將乙酰苯肼[3]（APH）150 mg/kg腹腔注射大鼠，48h后[4]經乙酰苯肼處理后的大鼠成為紅細胞氧化性溶血黃疸大鼠，再將這40只溶血性黃疸大鼠隨機分為陽性對照組（10只）、新生兒退黃中藥洗液高、中、低劑量組，每組10只。各洗液組給予38℃高、中、低濃度洗液1 000mL泡浴15min，1次/d，連續3d；正常組和陽性對照組給予等容積38℃自來水泡浴15min，1次/d，連續3d。

22 血清肝功能檢測 各組大鼠第三天藥浴或水浴結束1h后眼球取血2mL，用離心機3000r/min離心10 min，分離血清。按試劑盒說明書操作（TBIL/DBIL的測定使用釩酸鹽氧化法，ALT/AST使用底物法，TBA使用酶循環法），用全自動生化分析儀測定血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、TBA的活性。另間接膽紅素（IBIL）=TBIL-DBIL。

23 心肝肺腎肝組織形態的觀察 經眼球取血的大鼠立即處死，摘取心、肝、肺、腎臟，分別切取10cm×08cm×03 cm 心、肝、肺、腎組織1 塊，10%中性甲醛固定1周，逐級酒精脫水、二甲苯透明、浸臘、包埋、切片，片厚6μm，采用HE 染色方法，光鏡觀察各切片的組織形態。

心臟切片觀察有無心肌細胞壞死；腎臟切片觀察腎小球、腎小管的形態結構是否正常，腎小管內是否為膽紅素管型；肝臟切片觀察肝細胞的形態結構是否正常，膽管（肝管）是否有膽汁淤積，肝血竇中是否有擴張、充血、含鐵血黃素淤積以及膽紅素的淤積。肺臟切片觀察肺間質是否有充血、水腫以及肺泡隔是否有充血。并以輕、中、重度作為量化指標。

24 統計學方法 數據用SPSS170 軟件進行統計，以均數加減標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，P<005表示差異有統計學意義。

3 結果

31 大鼠肝功能變化 經乙酰苯肼造模后大鼠（陽性對照組、洗液各組）的血清肝功能指標TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA 均較正常組明顯升高（P<001），且以間接膽紅素升高為主；高、中、低濃度洗液組血清TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA低于陽性對照組（P<005），并高于正常組（P<005），組間比較無統計學意義（P>005）。見表1。

32 大鼠各組織病理切片的結果 各組大鼠的心臟、肺臟、腎臟肉眼未見明顯病變，鏡下組織切片亦未見異常：心肌細胞無壞死；腎小球、腎小管的形態結構正常，無膽紅素管型；肺臟肺間質無充血、水腫、肺泡隔無充血。在肝臟的組織病理比較中，除陽性對照組的肝臟肉眼可見輕微腫脹外，其余各組的肝臟肉眼未見明顯異常。陽性對照組肝臟組織切片鏡下見肝組織結構有明顯損害：肝血竇有輕中度擴張、充血；肝、膽管、肝管細胞及間隙見有棕黃色溶血浸潤（示有鐵血黃素淤積以及膽紅素的淤積）。而正常組、洗液高、中、低濃度組則未見明顯的肝血竇擴張和充血、無鐵血黃素淤積。見圖1。

4 討論

APH誘導的大鼠溶血性黃疸是常見的造模方法。APH是強氧化劑，通過干擾還原型谷胱甘肽的生成使紅細胞膜的穩定性遭到破壞致溶血性黃疸[5-6]。實驗中，陽性對照組血清的ALT，AST，TBIL 含量較正常組均顯著升高（P<001），并以間接膽紅素升高為主。另外，在肝組織病理切片可見陽性對照組的肝血竇擴張，充血明顯，鐵血黃素淤積程度較正常組明顯，表明造模成功。通過動物模型，可從機理探討疾病病理生理變化與中醫證候特征之間的關系[7]，并進行了以APH 150mg/kg腹腔注射大鼠，取得良好的效果，實驗中無大鼠的死亡。

經高、中、低濃度洗液組干預后的黃疸大鼠血清TBIL、DBIL、IBIL、AST、ALT、TBA含量均明顯低于陽性對照組（P<005），但仍與正常組差異具有統計學意義（P<001），表明洗液可降低APH所致的血清肝功能損害，降低黃疸水平，但未能根本糾正。各組間差異無統計學意義（P>005），說明實驗中選擇的3種濃度新生兒退黃洗液均有效，其退黃效果相當。另外各洗液組大鼠心肺腎組織切片均示為正常組織，表明洗液安全，對大鼠的心肺腎臟無明顯毒性損害。并可減輕溶血性黃疸大鼠的鐵血膽紅素的淤積。其退黃機理可能與模型大鼠通過藥液泡浴，藥物透皮吸收，進入體循環而降低大鼠膽紅素、改善肝功能的作用有關。

新生兒退黃中藥洗液中主要成分為茵陳、大黃、梔子和甘草等，具有利濕退黃、疏肝理氣、通便活血等作用。茵陳具有抗脂質過氧化和防止肝細胞壞死及肝脂肪變性的作用[8]。大黃通過減少膽汁酸及其他有害物質在肝臟中的蓄積，起到保肝利膽的作用 [9]。茵陳、梔子可通過還原組織中活性氧簇、誘導膽紅素產生限速酶血紅素加氧酶-1（HO-1）水平上調等機制達到減少膽紅素產生、抗氧化作用，并可改善肝損害[10]。通過泡浴的方式，洗液中有效成分通過皮膚吸收，達到促進膽汁分泌及排泄，降低膽紅素的功效。

綜上所述，新生兒退黃中藥洗液通過促進大鼠血清膽紅素代謝排出、保肝利膽從而達到退黃的作用。

參考文獻

[1]高桂娥，吳曙粵，黃仕孫，等.新生兒退黃外洗液的制備及臨床療效觀察[J].中成藥，2006，28（11）：附4-5.

[2]吳曙粵，王艷寧，高桂娥，等.新生兒退黃中藥外洗液的臨床開發研究[J].廣西醫學，2009，31（12）：1755-1759.

[3]劉春芳，喬利，王艷偉，等.黃連和小檗堿對大鼠紅細胞氧化性溶血及其抗氧化系統的影響[J].中國實驗方劑學，2010，16（6）：156-159.

[4]程生輝，張妍妍，李會芳，等.基于黃疸模型大鼠的梔子苷急性肝腎毒性研究[J].中國實驗方劑學，2015，21（4）：174-178.

[5]杜先婕，宋林奇，謝人明，等.復方阿膠漿對乙酰苯肼所致小鼠溶血性貧血模型的實驗研究[J].中成藥，2009，31 （5）：790-793.

[6]Croci S， Pedrazzi G， Passeri G， et al.Acetylphenylhydrazine induced haemoglobin oxidation in erythrocytes studied by Mssbauer spectroscopy[J].Biochim Biophys Acta，2001，15（1）：99-104.

[7]熊新貴，梁清華，陳疆，等.高血壓性腦出血肝陽化風證大鼠模型的建立[J].湖南中醫藥大學學報，2007 ， 27 （6）：11-14.

[8]孟繁欽，吳宜艷，雷濤，等.茵陳的藥理作用及臨床應用進展[J].牡丹江醫學院學報，2009，30（1）：46-48.

[9][JP+1]傅興圣，陳菲，劉訓紅，等.大黃化學成分與藥理作用研究新進展[J].中國新藥雜志，2011，（16）： 1534-1538，1568.[JP]

[10]游偉良，平其能，孫敏捷，等. 梔子苷的藥理學研究新進展[J].藥學進展，2012，36（4） ：158-162.

（編輯：陶希睿）