ITC研究達卡巴嗪與DNA反應動力學

王 歡， 王 姣， 李宗孝， 趙微微， 蒲小華， 程花蕾

(寶雞文理學院 化學化工學院， 陜西省植物化學重點實驗室， 陜西 寶雞 721013)

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ITC研究達卡巴嗪與DNA反應動力學

王 歡， 王 姣， 李宗孝， 趙微微*， 蒲小華， 程花蕾

(寶雞文理學院 化學化工學院， 陜西省植物化學重點實驗室， 陜西 寶雞 721013)

利用等溫滴定量熱(ITC)、光譜、粘度測量等方法，研究了小牛胸腺DNA與抗癌藥物達卡巴嗪的相互作用。結果表明：達卡巴嗪與DNA作用后，吸收光譜會出現增色、藍移和粘度減小等現象。采用ITC法得到了結合常數以及結合位點數，發現達卡巴嗪與DNA以非經典嵌插式及表面作用兩種方式結合。對于嵌插式，ΔH1<0，ΔS1>0，K1=5.63×104，結合位點數0.10；對于藥物分子僅與DNA表面發生作用而并未嵌入到DNA分子的疏水部分的結合方式，ΔH2>0，ΔS2>0，K2=1.00×103，結合位點數9.99。同時發現紫外法得到的結合常數是Ka=6.70×104，與ITC的嵌插式吻合。

DNA； 達卡巴嗪； 光譜法； 作用機理； 等溫滴定量熱

1 引 言

生物大分子包括蛋白質、核酸、脂類、糖類等，它們參與了生命活動的所有過程[1-3]。DNA是生物體內最重要的生物大分子，是絕大多數生物遺傳信息的載體，對生物的遺傳進化起著重要的作用。許多外源性的小分子可以與DNA結合，這種相互作用能引起DNA的斷裂，或者改變DNA的結構，破壞其作為核酸模板的功能，影響DNA復制和轉錄等功能，導致細胞癌變、突變或者死亡[4-8]。近年來，許多學者對于小分子與DNA的相互作用做了研究：劉振佳等[9]利用圓二色譜技術研究了DNA 與小分子化合物的相互作用；龍泉鑫等[10]對喹諾酮類藥物斷裂復合體與DNA復制的抑制進行了研究；鐘文英等[11]探討了巴羅沙星與DNA的相互作用及Mg2+的影響。但廣譜抗腫瘤藥物達卡巴嗪 (Dacarbazine,DAC)與DNA的作用尚未見報道。本文利用ITC法檢測探討了DAC導致癌細胞死亡的作用機制及抗癌原理，闡述了反應的驅動力。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

實驗中使用的儀器主要有NANO 等溫滴定量熱儀(美國TA)、UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津)和Advantage A10超純水處理系統(美國Millipore Q)。

實驗中使用的試劑主要有達卡巴嗪(DAC)、小牛胸腺DNA、三羥甲基氨基甲烷(AR，Tris)和鹽酸(AR，HCl)。所需溶液均用Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1，pH=7.40)溶解，用DNA 在260 nm處的吸光度與280 nm處的吸光度比值檢驗其純度(A260/A280>1.80)。DNA濃度利用ε260=6 600 L·(mol·cm)-1來確定。溶液均于4 ℃的冰箱中儲備。實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm，25 ℃)。

2.2 實驗方法

采用等溫滴定量熱法、粘度法、紫外吸收法對DNA與DAC的相互作用進行測試和分析。

3 結果與討論

3.1 DNA-DAC的吸收光譜

在常壓及25 ℃下，以Tris-HCl作緩沖液(0.05 mol·L-1，pH=7.40)，CDNA=5.82×10-5mol·L-1，CDAC=5.81×10-5mol·L-1，分別繪制吸收光譜，如圖1所示。

圖1分別為DNA、DAC及DNA與DAC作用后的紫外吸收曲線。其中DNA和DAC吸收值的和不完全等于DNA-DAC的吸收值，二者相差0.049。這可能是因為藥物DAC與DNA作用形成了復合物，從而導致DNA紫外吸收性質的改變，使得特征峰強度增大，最終導致單純的DNA、DAC線的疊加不等于DNA-DAC線之值。

圖1 DNA、DAC及DNA-DAC在Tries-HCl ( 0.05 mol·L-1, pH =7.40)中的紫外吸收光譜。

Fig.1 UV absorption spectra of DNA, DAC and DNA-DAC in Tris-HCl ( 0.05 mol·L-1, pH=7.4 ), respectively.

3.2 DAC與DNA的作用方式推斷

按3.1的方法，固定DNA濃度(2.05×10-4mol·L-1)，將DAC濃度由5.53×10-6mol·L-1增加到3.73×10-5mol·L-1，獲得紫外光譜如圖2 所示。

圖2 室溫下達卡巴嗪與DNA相互作用的紫外-可見吸收光譜

Fig.2 UV-Vis absorption spectra of the interaction between DNA and DAC at room temperature

一般而言，DNA的堿基在250～270 nm之間有吸收，其特征吸收峰在260 nm處，該特征峰常用于確定DNA 的濃度。通過DNA 和小分子藥物作用的增色/減色效應或者吸收帶的紅移/藍移等現象[12-13]，可以確定藥物分子和DNA 作用的方式。

圖2顯示， DNA在300～360 nm區間沒有吸收峰，但隨著DAC的逐漸加入，在330 nm附近出現新的吸收峰，該吸收峰是DAC的特征吸收；同時，在260 nm處的DNA特征吸收峰隨著DAC濃度的增加出現增色效應，并伴隨微小的吸收帶藍移。這表明藥物DAC沒有插入到DNA堿基對之間的平面中，說明DAC與DNA并不是以經典的嵌插結合模式結合，而是以其他方式結合。

若以CDNA表示DNA的濃度,εf、εa和εb分別代表自由態、部分結合和完全結合的化合物的摩爾消光系數，按照公式[14]

(1)

并以CDNA/(εa-εf)對CDNA作圖,得到圖3。

由截距1/Ka(εb-εf) 得該體系的結合常數Ka為6.70×104L·mol-1。

3.3 利用DNA的熔點特征確定結合方式

常壓下，分別將DNA、DNA-DAC置于恒溫水浴槽中，從25 ℃開始每間隔5 ℃測定DNA、DNA- DAC兩種體系在260 nm處的吸光度。以fss=(A-A0)/(Af-A0)對溫度T作熱變性曲線(其中，A0和Af分別為25 ℃和 100 ℃時體系260 nm處的吸光度。A為溫度變化時體系260 nm對應的吸光度)。當fss=0.5時，對應的溫度即為熔點Tm，得圖4。

通常情況下，DNA的雙螺旋結構在加熱或堿性條件下會遭到破壞，導致雙鏈間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈結構。Sun等[15]證明：當DNA與小分子藥物相互作用時，Tm會發生變化。若Tm上升了5～8 ℃，表明DNA雙螺旋會更加穩定，二者的結合為嵌插結合，而靜電結合或溝槽結合對Tm無明顯影響。如圖4所示，游離 DNA 的Tm為85.54 ℃，DNA-DAC體系的Tm為86.02 ℃，顯然Tm無明顯變化，表明DAC與DNA不是以嵌插方式結合。這也證明3.2的推斷是正確的。

Fig.4 Thermal melting profiles of DNA(■) and its complexes with DAC(●)

3.4 粘度法的再利用

(2)

由圖5可以看出，隨著DAC濃度的增加，DNA溶液的相對粘度逐漸減小。這是因為藥物DAC以部分、非經典嵌插方式與DNA結合[17]，使得DNA螺旋結構扭曲，因而有效長度減小，從而導致DNA溶液的相對粘度降低。

3.5 反應驅動力的確定

等溫滴定量熱技術是近年來發展起來的新興技術，用于生物熱力學與動力學研究，其優點為原位、快速、無損傷，已成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法。它可直接定量監測反應過程的熱量變化，確定反應過程的熱動力學參數，諸如結合常數Ka、結合位點數n、反應焓變ΔH、熵變ΔS等，用以表征分子間的相互作用[18-21]。

在25 ℃下將DAC加入250 μL的注射器中注入裝有DNA溶液的樣品池并持續攪拌，每次滴加5 μL共50次，每次間隔300 s。采用上面同樣的設置以DAC溶液滴定緩沖溶液作為對照試驗，扣除稀釋熱的作用。圖6 為達卡巴嗪滴定DNA的等溫滴定曲線。使用NanoAnalyze軟件的所有數據進行分析，得到DAC滴定DNA的熱力學參數于表1。

由表1可知,雖然n2比n1大，但結合常數K1卻大于K2，顯示出第一類結合要比第二類結合穩定牢靠。這是因為在第二類結合中，藥物分子僅與DNA表面發生作用而并未嵌到DNA分子的疏水部分。由于作用物之間相互作用于表面，所以容易形成較大的結合位點數，但作用力分散，親合力較弱。然而當藥物小分子以非經典嵌入到DNA雙螺旋結構并與堿基對相結合時,則能成為較穩定的第一類結合。

SitenKa/(10-3L·moL-1)ΔH/(kJ·moL-1)ΔG/(kJ·moL-1)TΔS/(kJ·moL-1)First0．1056．33-12．33-27．1114．78Second9．991．001．57-17．1218．69

第一類結合時，ΔH1<0，ΔS1>0，結合常數為5.63×104，顯然，該過程放熱，且熱熵為正。其原因有二：藥物小分子的疏水部分深深地陷入了DNA分子的疏水局部，導致體系能量降低而放熱；藥物分子的陷入，促使疏水空腔部分溶劑水分子進入溶液本體，轉變為自由水分子。以上兩個過程都有一定的熱量放出，進而使體系混亂度增加。但在考慮作用過程時，藥物分子靠近DNA時本身的去水化作用和結合位點周圍水化層的被破壞所引起的吸熱效應也必須予以考慮，不過這種吸熱效應明顯小于上述兩因素導致的放熱效應，因此，第一類結合表現為放熱熵增現象，導致該過程的ΔG1<0，該過程的主要驅動力為疏水作用力。

第二類結合時，ΔH2>0，ΔS2>0 ，結合常數為1.00×103，該過程吸熱，且熱熵為正，結合常數比第一類小。這是由于藥物分子在接近DNA表面時發生了去水化作用并且DNA表面水化層被破壞，藥物分子并沒有進入DNA分子內部，而是在表面進行。因為TΔS2>|ΔH2|熵增效應較大并決定著該過程的ΔG2<0，故表現為熵驅動過程，靜電作用力是其驅動力。

以上兩類結合的ΔG均小于0，說明均可自發進行，都可形成穩定的化合物。

4 結 論

通過紫外滴定、熔點以及粘度實驗證明DNA與DAC結合方式為非經典、部分嵌插式。等溫滴定量熱實驗結果表明，DNA與DAC反應有兩類結合位點，反應均可自發進行。第一類發生在DNA分子內部，結合穩定，為熵驅動為主的焓熵協同驅動過程，疏水作用是其主要驅動力；第二類發生在DNA分子表面，為熵驅動過程，靜電相互作用是其主要推驅力。

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王歡(1991-)，男，陜西寶雞人，碩士研究生，2014年于寶雞文理學院獲得學士學位，主要從事天然產物、抗癌藥物與生物大分子的相互作用的研究。E-mail: 15829499347@163.com

趙微微(1984-)，女，陜西渭南人，博士，助教，2016年于西北大學獲得博士學位，主要從事多功能納米載體的制備及其可控釋放藥物的研究。E-mail: gengts@163.com

Interaction Dynamics Between Dacarbazine and DNA

WANG Huan, WANG Jiao, LI Zong-xiao, ZHAO Wei-wei*, PU Xiao-hua, CHENG Hua-lei

(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Baoji University of Arts and Sciences,ShannxiKeyLaboratoryofPhytochemistry,Baoji721013,China)*CorrespondingAuthor,E-mail:gengts@163.com

The interaction between calf thymus DNA and anti-cancer drug dacarbazine was investigated using isothermal titration calorimetry(ITC), spectroscopy, viscosity and other methods. The hyperchromic effect and blue shift in the absorption spectra as well as viscosity decline are observed clearly after the interaction between dacarbazine and DNA. Furthermore, the binding constant and number of binding sites are also recorded by ITC, presenting that the interactions of the dacarbazine with DNA can be categorized for two modes: a non-classical intercalation type and surface binding effect. In former, ΔH1<0, ΔS1>0,K1=5.63 × 104, the binding site is 0.10. In latter, only surficial interaction during the combination of the drug molecule with DNA occurs, not embedding into the hydrophobic part of the DNA molecule, due to ΔH2> 0 , ΔS2> 0,K2=1.00 × 103, and the binding site of 9.99. Meanwhile, UV method is also employed to find the binding constant ofKa=6.70×104, which is consistence with ITC observation.

DNA; dacarbazine; spectroscopy; interaction mechanism; isothermal titration calorimetry

1000-7032(2016)12-1560-06

2016-07-03；

2016-10-09

國家自然科學青年科學基金(21501007)； 陜西省自然科學基金(2012Jm2019)； 陜西省教育廳項目(14JK1045)資助

O657.3

A

10.3788/fgxb20163712.1560