石斛合劑對db/db小鼠肝胰島素信號通路蛋白表達的影響

張捷平 王曉寧 余文珍 鄭燕芳 陳雪花 施 紅

(福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州，350122)

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石斛合劑對db/db小鼠肝胰島素信號通路蛋白表達的影響

張捷平 王曉寧 余文珍 鄭燕芳 陳雪花 施 紅

(福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州，350122)

目的：觀察石斛合劑序貫治療對db/db小鼠肝胰島素信號通路蛋白基因表達的影響，探討其調節血糖的分子機制。方法：選取12～14周齡雄性db/db小鼠，按空腹血糖及體質量隨機分成模型組、二甲雙胍組、石斛合劑序貫組(以下簡稱序貫組)；選db/m為正常對照組。連續灌胃給藥共6個循環(54 d)。觀察各組治療后各組空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量(OGTT)、糖化血清蛋白(GSP)、血清胰島素(Ins)、三酰甘油(TG)及膽固醇(Tch)，同時提取肝組織RNA，以逆轉錄PCR法檢測胰島素受體(InsR)、胰島素受體底物1/2(IRS1/2)、PI3K mRNA表達水平變化。結果：與模型組比較，序貫組FBG、GSP和Ins顯著下降(P<0.05)，改善葡萄糖耐量(P<0.05～0.01)；InsR、IRS1/2、PI3K等mRNA表達增加(P<0.05～0.01)。結論:復方石斛合劑序貫治療能有效降低db/db小鼠的降低高胰島素血癥，降低空腹血糖及血脂，改善葡萄糖耐量，可能與增加InsR、IRS1/2、PI3K等基因表達有關。

石斛合劑；胰島素信號；基因表達

胰島素抵抗是指各種原因導致生理劑量的胰島素不足以對靶細胞產生正常生物學效應，機體代償性的分泌過多胰島素產生高胰島素血癥，其是糖尿病發生與演變的重要病理特征。研究表明，胰島素信號通路蛋白結構與數量的異常，是胰島素抵抗的重要原因[1]。前期臨床與基礎研究表明石斛合劑能減少2型糖尿病模型動物胰島細胞凋亡、促進胰島素分泌，降低血糖，改善血脂，減輕2型糖尿病患者胰島素抵抗的作用[2-6]。本研究擬從胰島素信號角度，觀察石斛合劑對胰島素信號蛋白基因表達的影響，從而進一步闡明其改善糖脂代謝、緩解胰島素抵抗的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級db/db小鼠18只，體質量為(45.2±3.2)g；db/m小鼠6只，體質量為(26.2±2.3)g。所有小鼠均為雄性，12～14周齡。由北京大學(醫學部)實驗動物科學部提供(許可證號為SCXK(京)2011-0012)，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級環境，自由攝食、飲水，室溫20～23 ℃，空氣流通，相對濕度55%～70%，12 h光照晝夜循環。

1.2 藥物 石斛合劑1方(石斛、黃芪、五味子、葛根、玄參、黃連、丹參、梔子、瓜蔞等)，石斛合劑2方(茵陳、大黃、梔子、柴胡、車前子、瞿麥等)，上述中藥飲片購于福建中醫藥大學國醫堂。以6倍體積水煎2次后過濾，濾液合并后分別濃縮至含生藥量2 g/mL、1 g/mL)，二甲雙胍(20 mg/mL，批號：H20023370，中美上海施貴寶制藥有限公司)。

1.3 試劑及儀器 胰島素(insulin，Ins)放免試劑盒(批號20150320，北京市福瑞生物工程公司)，三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，Tch)、糖化血清蛋白(glycosylated serum protein，GSP)檢測試劑盒(批號20150120，20150115，20150301，南京建成生物技術公司)，Trizol(批號15596026，美國Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(批號00111863，Fermentas公司)，實時定量PCR試劑盒(批號AK5501，寶生物工程(大連)有限公司)，DU730型核酸蛋白分析儀(BACKMAN公司)，拜安捷型快測血糖儀(拜爾醫藥保健有限公司)，7500 Fast Dx型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.4 分組及給藥db/db小鼠適應性喂養1周后，選取空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)≥11.1 mmol/L為糖尿病模型，按FBG及體質量分層后，隨機分為模型組、西藥組、石斛合劑序貫組(以下簡稱序貫組)，每組各6只。另取6只表型正常的db/m小鼠為正常組。西藥組給予二甲雙胍0.2 g/(kg·d)；序貫組以石斛合劑(藥量按小鼠與人體表比換算法計算，相當于臨床用量12倍)序貫治療，1方(24 g/kg·d)4 d，續以2方(12 g/kg·d)3 d為1個療程，每次換方停藥1 d，共6個療程(54 d)。正常組與模型組均按體質量給予等體積生理鹽水。各組均為灌胃給藥，2次/d。

1.5 指標觀察

1.5.1 口服糖耐量試驗(OGTT) 治療周期結束后，禁食不禁水10 h，測空腹血糖后，小鼠按2 g/kg葡萄糖灌胃，測定0.5 h、1 h、2 h的血糖。

1.5.2 血清學指標測定 第二天，禁食后眼眶采血，分離血清，采用放射免疫學方法檢測Ins，氧化酶法測定TG與TC，果糖胺法測定GSP。同時，取肝組織液氮保存。

1.5.3 RT-PCR檢測肝組織胰島素信號蛋白mRNA表達 采用TRIzol法提取大鼠肝細胞總RNA，并瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以Olig(dT)18為引物42 ℃逆轉錄合成cDNA。根據GeneBank提供的基因序列，以Prime 5.0軟件設計InsR、IRS1、IRS2、PI3K、β-actin基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見表1。實時熒光定量PCR擴增反應體系20 μL，含SYBR Primix Ex TaqTMⅡ10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，循環條件為：95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，共40個循環。采用2-△△Ct方法對相應基因mRNA的表達進行定量分析，即處理組基因表達相對于正常對照組的變化倍數為2-△△Ct倍。

表1 實時定量PCR的引物

2 結果

2.1 石斛合劑對db/db小鼠OGTT的影響 與正常組比較，模型組db/db小鼠FBG明顯上升(P<0.01)，在口服葡萄糖0.5 h后血糖明顯上升(P<0.01)，1 h、2 h血糖下降緩慢(P<0.01)。與模型組比較，西藥組與序貫組FBG均明顯下降(P<0.01)，在口服葡萄糖0.5 h后血糖低于模型組(P<0.05)，1 h、2 h血糖持續下降(P<0.01)，西藥組與序貫組無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2 石斛合劑序貫治療對db/db小鼠GSP、Ins、Tch和TG的影響 與正常組比較，模型組db/db小鼠的GSP、Ins、Tch和TG明顯升高(P<0.05～0.01)；與模型組比較，西藥組二甲雙胍治療使GSP、Ins、Tch和TG均有顯著性下降(P<0.05～0.01)；序貫組GSP、Ins和TC均有顯著性下降(P<0.01)，TG有所下降，但變化無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 石斛合劑序貫治療對db/db小鼠OGTT的影響

注：*表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；**表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)；△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；△△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 石斛合劑序貫治療對db/db小鼠GSP、Ins、TC和TG的影響

注：*表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；**表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)；△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；△△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 石斛合劑對db/db小鼠肝InsR、IRS1、IRS2和PI3K mRNA表達比率的影響

注：*表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；**表示與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)；△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；△△表示與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 石斛合劑對db/db小鼠肝InsR、IRS1、IRS2和PI3K mRNA表達比率的影響 與正常組相比較，模型組肝細胞InsR、IRS1/2、PI3K mRNA均呈現表達下降(P<0.01)；與模型組比較，西藥組與序貫組InsR、IRS1/2、PI3K有不同程度表達增加，(P<0.01)。見表4。

3 討論

糖尿病屬中醫學的“消渴”范疇。各種因素如飲食不節、勞欲過度、稟賦不足、情志失調等，均可導致氣機郁結，郁久積熱，傷陰化燥，出現“消渴”；日久陰傷氣耗，使氣陰兩傷，經脈失于濡養，陰陽氣血失調，最終導致陰陽兩虛。施紅教授根據長期臨床研究，提出“陰虛為本，燥熱為標，血瘀貫穿是始終，并呈現階段性的痰、濕、熱”是糖尿病的基本病機特點；通過臨床-基礎-臨床的反復探索，形成“滋陰益氣活血泄濁”序貫的新療法[7]。即在西醫糖尿病基礎治療，使用石斛合劑1號方(5 d)+2號方(3 d)，反復循環治療。1號方以石斛、生地黃、知母滋陰清熱，黃芪、丹參益氣活血，五味子、葛根補益脾腎，諸藥相須為用，上中下兼顧，甘溫化氣，酸甘養陰，苦寒清熱潤燥，三消分治；2號方以茵陳清利濕熱，梔子通利三焦，大黃瀉熱逐瘀，扁蓄除濕止癢，以滑石佐清利濕熱，諸藥合力以清肝利濕泄濁，利于濁毒排出體外。臨床資料顯示該序貫療法可明顯改善陰虛熱盛、氣陰兩虛證的2型糖尿病患者燥熱、煩渴、盜汗等臨床癥狀，顯著降低血糖，改善血脂[8]。

db/db小鼠是C57BL/6J小鼠中瘦素受體基因缺陷的突變系，具有高胰島素血癥、高血糖、肥胖等代謝異常，是類人類2型糖尿病理想的動物模型之一。由于db/db小鼠瘦素受體基因缺陷，形成瘦素抵抗狀態，導致胰腺β細胞分泌胰島素持續增加，產生高胰島素血癥[9]。高胰島素血癥是胰島素抵抗的關鍵始動因素之一，持續高胰島素狀態可降低外周組織細胞的胰島素受體表達，減弱胰島素信號的轉導，從而減少細胞對葡萄糖的氧化利用，反饋刺激胰島素分泌進一步增加，造成惡性循環[1]。故降低高胰島素血癥，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，是降低血糖及治療糖尿病的關鍵環節。

本實驗我們觀察到db/db小鼠表現嚴重的高胰島素血癥，糖耐量受缺損，OGTT試驗的血糖持續維持高水平，血脂TG與Tch明顯上升，反映機體處于嚴重胰島素抵抗狀態，糖脂代謝紊亂。經過石斛合劑的序貫治療，db/db小鼠的葡萄糖耐量增加，血脂TG與Tch有不同程度的降低，血清胰島素水平明顯下降，提示糖脂代謝顯著改善，其可能與胰島素水平下調，胰島素敏感性增加有關。

在胰島素信號轉導過程中，胰島素與靶細胞表面的胰島素受體(Insulin Receptor，InsR)α亞基結合，誘導細胞內的β亞基自我磷酸化并表現出酪氨酸激酶活性。胰島素受體底物1/2(Insulin Receptor Substrates1/2，IRS1/2)通過識別并結合磷酸化的InsR被活化，進一步激活其下游磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy Kinase，PI3K)，催化生成3,4,5-三磷酸脂酰肌醇，通過變構調節激活磷酸肌醇依賴性激酶(Phosphoinositide-dependentkinase，PDK)，活性化Akt，進而通過調節Glut4、GSK-3、Foxo1等蛋白參與代謝調節[10]。因此，胰島素信號轉導的蛋白結構異常或數量的減少，都將導致信號轉導的障礙，影響胰島素的生理效應減弱，產生代謝紊亂[11]。大量研究表明，不同中藥或復方可通過調節胰島素信號轉導，促進糖脂代謝[12]。如小檗堿、麥冬多糖、黃芪多糖、葛根素、牡丹皮多糖、大黃等提高InsR、IRS1、PI3K表達水平，激活PI3K/Akt通路，增加對胰島素的敏感性，調節胰島素信號轉導。

在本實驗中，我們觀察到具有高胰島素血癥的db/db小鼠肝細胞InsR明顯下降，這與前期實驗高胰島素培養的HepG2細胞表現一致[13]，同時肝細胞IRS1、IRS2與PI3K等下游信號蛋白mRNA表達也出現不同程度表達下調，提示在高胰島素狀態下，InsR表達下調導致與胰島素結合率下降，胰島素信號跨膜轉導障礙，IRS1/2、PI3K基因表達減少加重胰島素抵抗的程度。經石斛合劑序貫治療后，InsR、IRS1/2、PI3K mRNA表達出現明顯增加。我們推測InsR基因表達的上調有助于提高胰島素與受體的結合率，增加胰島素敏感性，加速胰島素信號的跨膜轉導；同時胞內胰島素信號蛋白IRS1/2、PI3K的基因表達增加，有助信號繼續快速傳遞，從而緩解胰島素抵抗，改善糖脂代謝。

綜合上述結果分析，石斛合劑序貫治療能明顯降低db/db小鼠FBS、GSP、糖化血清蛋白、血脂與胰島素水平，改善糖耐量，可能與促進胰島素信號通路蛋白InsR、IRS1/2、PI3K基因表達有關。為石斛合劑臨床有效防治糖尿病、改善胰島素抵抗，提供理論依據。真核生物的基因表達調控主要受順式作用元件(如啟動子)與反式作用因子(如轉錄因子)相互作用的調節，這將是今后探索調節基因表達分子機制的重要切入點。此外，血液循環中胰島素水平受胰島β細胞的胰島素分泌率與胰島素清除率的共同調節。目前認為受體介導的內吞作用是胰島素清除的主要機制，胰島素降解酶是其關鍵酶[14-15]。因此，石斛合劑對高胰島素血癥的下調作用，是否通過抑制胰島素分泌或(和)促進胰島素內吞降解有關，也值得進一步研究。

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(2016-07-25收稿 責任編輯：洪志強)

Effect of Shihu Compound on the Expression of Proteins of Hepatic Insulin Singal Pathways indb/dbMice

Zhang Jieping, Wang Xiaoning, Yu Wenzhen, Zheng Yanfang, Chen Xuehua, Shi Hong

(FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

Objective:To observe the effect of Shihu Compound (DC) sequential therapy on gene expression of protein of hepatic insulin signal pathways indb/dbmice and to discuss the molecular mechanism of regulating blood sugar. Methods:Eighteen maledb/dbmice of 12～14 weeks old were randomly divided into model group, metformin group, and DC group according to FBG and body mass. Sixdb/mmice were taken as normal control group. They were given by continuous gavage for 6 circles (54 d). OGTT were measured at the end of the experiment. The concentrations of FBG, GSP, insulin, TG and Tch in sernm were measured, and the expression of insulin receptor， insulin receptor substrate 1/2 and PI3K in liver were assayed RT-PCR. Results:Compared with model group, FBG, Ins and GSP in DC group and metformin group decreased significantly (P<0.05), and glucose tolerance improved (P<0.05～0.01). The level of mRNA expression on InsR, IRS1/2 and PI3K were increased. Conclusion:Dendrobium Compound sequential treatment effectively reduced glucose and lipid， and improved glucose tolerance indb/dbmice,which could be associated with increased the expressions of components in the insulin signal pathway, such as InsR, IRS1/2 and PI3K．

Dendrobium compound；Insulin signal；Gene expression

福建省自然科學基金項目(編號：2013J01332)；福建中醫藥大學重點學科專項校管課題(編號：X2014026-學科)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.043