玉米籽粒容重動態(tài)變化的QTL分析

許蒙蒙，秦永田，陳永強，張戰(zhàn)輝，湯繼華，付志遠

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玉米籽粒容重動態(tài)變化的QTL分析

許蒙蒙1，秦永田2，陳永強1，張戰(zhàn)輝1，湯繼華1，付志遠1

（1河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州450002；2河南省鶴壁市農(nóng)業(yè)科學院，河南鶴壁456284）

【目的】鑒定玉米籽粒灌漿過程中控制容重動態(tài)變化的QTL，為容重相關(guān)關(guān)鍵基因的克隆奠定基礎。【方法】利用一套來源于玉米雜交種農(nóng)大108（許178×黃C）的包含166個家系的RIL群體，于2009年和2010年分別在鄭州、安陽按隨機區(qū)組設計進行種植。開花時選擇生育期一致的植株掛牌，并在授粉后15、22、29、36、43和50 d分期收獲，風干穗樣籽粒，測定重組近交系群體灌漿不同時期籽粒的容重變化，容重相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析用SPSS18.0軟件進行。利用覆蓋全基因組的822對SSR標記獲得親本間的多態(tài)性標記信息，選擇216對在親本和群體中帶型都很清晰的多態(tài)性SSR標記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。以構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜為基礎，利用WinQTLCart 2.5復合區(qū)間作圖在0.05顯著水平進行1 000次模擬，檢測控制容重動態(tài)變化相關(guān)的QTL?！窘Y(jié)果】農(nóng)大108及其親本容重隨籽粒灌漿進程的推進不斷增加，且呈現(xiàn)慢-快-慢的趨勢。遺傳因素是影響容重的主要因素，環(huán)境因素對容重的影響在籽粒灌漿高峰期較前期和后期小。不同年份間，容重在灌漿DAP22至DAP43期間表現(xiàn)出顯著的差異，但最終的容重在年份間差異較小。在籽粒灌漿不同時期，農(nóng)大108的容重表現(xiàn)多介于雙親之間，沒有出現(xiàn)超親優(yōu)勢情況，表現(xiàn)典型的加性效應。對RIL群體容重性狀進行測驗，在不同年份間籽粒灌漿過程中均存在顯著差異。4個環(huán)境條件下，6個籽粒發(fā)育時期，共檢測到31個容重相關(guān)的QTL，分布在玉米第1、2、3、5、6、7、8和9染色體上，分別有2、4、5、3、4、5、3和3個QTL。這些QTL中，13個QTL的加性效應來自親本黃C（正值），18個QTL的加性效應來自親本許178（負值）。單個QTL對容重表型的貢獻率在5.9%—29.7%。在2010年安陽試點DAP22和DAP36被檢測到，貢獻率分別為11.5%和14.7%；在2009年鄭州試點DAP29和DAP36被檢測到，貢獻率分別為22.2%和14.7%?！窘Y(jié)論】和是在不同時期同時被檢測到的玉米籽粒容重動態(tài)變化的主效QTL，對容重表型的貢獻率均在10%以上，所在的染色體區(qū)域可作為后續(xù)玉米籽粒容重發(fā)育的重要研究目標，用于容重相關(guān)基因的圖位克隆及功能研究。

玉米；灌漿；容重；QTL

0 引言

【研究意義】玉米是中國第一大糧食作物，在國家糧食安全的保障中具有極其重要的地位。隨著玉米商業(yè)化用途的發(fā)展，中國自2010年開始從國際市場進口玉米，而且進口量逐年增加，2012年玉米成為中國第一大糧食作物[1]。容重作為重要的籽粒性狀和商品品質(zhì)衡量指標，在玉米育種工作中越來越受到重視。從分子水平解析玉米籽粒灌漿過程中容重的遺傳規(guī)律，有助于提高玉米產(chǎn)量和商品品質(zhì)。容重能夠反映籽粒的成熟度、完整度、均勻度和使用價值，是評價玉米商品品質(zhì)的重要指標，且已成為國際貿(mào)易中質(zhì)量定級的重要因素[2-4]。在產(chǎn)量構(gòu)成因素穗行數(shù)和行粒數(shù)保持不變的條件下，容重在一定程度上可以作為衡量籽粒大小的指標，通過對容重性狀進行選擇可有效提高籽粒產(chǎn)量[5]。同一體積內(nèi)籽粒數(shù)目和質(zhì)量越大，容重越高，籽粒數(shù)目和質(zhì)量大小取決于籽粒的整個生長發(fā)育過程?！厩叭搜芯窟M展】胚乳占玉米籽粒的85%，胚乳發(fā)育不良，籽粒充實度差，必然導致籽粒容重的降低[6]。玉米胚乳的發(fā)育包括籽粒庫容的建成及籽粒庫的充實過程[7]。籽粒容重大小的一個重要決定因素是籽粒重量，灌漿速率及持續(xù)期的長短是影響玉米籽粒重量的關(guān)鍵因素，不同品種粒重的差異也是由灌漿造成的[8]。影響玉米灌漿過程的重要因素有相關(guān)酶的活性[9]、溫度[10]、葉片氮素含量和衰老[11]等。趙延明等[12]研究表明，玉米籽粒容重受胚乳基因效應和胚基因效應的影響，其中胚乳基因效應占主要地位。張麗等[13]研究表明淀粉粒的形態(tài)特征及排列特性的差異是造成容重差異的根本原因。羅希榕等[14]分析了72個玉米雜交組合的籽粒容重與產(chǎn)量及其相關(guān)性狀之間的關(guān)系，結(jié)果表明，籽粒容重與百粒重極顯著正相關(guān)。通過胚乳突變體（Opaque-2、Floury-2和高直鏈淀粉）研究表明，賴氨酸含量的增加和直鏈淀粉含量的增加都會降低容重[15-17]。2016年，劉海天等[18]針對品種、密度、施肥和播期栽培技術(shù)對玉米籽粒容重的影響進行了深入探討發(fā)現(xiàn)，籽粒容重在不同玉米品種之間存在差異，不同品種間籽粒容重受年度影響也不相同，密度對籽粒容重影響不明顯，而施肥量對玉米籽粒容重影響較大。智建奇等[19]對2003—2012年山西省審定玉米品種的容重進行分析得知，因遺傳基因控制2003—2012年山西省審定玉米品種的平均容重有升高的趨勢，進而提出加強專用型玉米選育迫在眉睫。在其他植物中，Pixey等[20]通過對燕麥優(yōu)良種質(zhì)容重的遺傳變異性的研究發(fā)現(xiàn)容重與產(chǎn)量之間有一定程度的正相關(guān)，且兩者都有顯著的基因型差異和高遺傳力，生產(chǎn)上可以通過提高容重來培育高產(chǎn)燕麥品種。此外，物理因素如籽粒大小、胚乳硬度、含水量和粒型與容重也有密切關(guān)系[13,17,21]。在容重性狀遺傳機理研究方面，Peng等[22]和Ding等[23]分別用不同的F2:3群體定位了容重相關(guān)數(shù)量性狀位點（quantitative trait loci，QTL），前者認為加性效應是容重形成的主要原因，后者認為除加性效應外，上位性互作也是容重形成的重要遺傳基礎?！颈狙芯壳腥朦c】多數(shù)研究主要集中在生理和形態(tài)指標分析方面，對影響籽粒容重的遺傳因素研究較少，且從整個籽粒灌漿過程對容重的動態(tài)變化進行遺傳分析更是鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬以農(nóng)大108衍生的重組近交系（recombinant inbred line，RIL）群體為基礎材料，通過復合區(qū)間作圖鑒定玉米籽粒灌漿過程中控制容重動態(tài)變化的QTL，以期為容重相關(guān)關(guān)鍵基因的克隆奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為一套包含166個家系的RIL群體，RIL群體來源于中國一個大面積推廣的優(yōu)良玉米雜交種農(nóng)大108，親本為黃C和許178，采用人工授粉，從黃C和許178的F2代開始每代隨機選株，自交八代，在2008年獲得包含166個家系的RIL群體。農(nóng)大108是中國大面積推廣的雜交種，是進行QTL定位和雜種優(yōu)勢的理想群體。

1.2 田間表型鑒定

于2009年和2010年夏，分別在河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)（鄭州）和安陽市農(nóng)業(yè)科學院（安陽）試驗基地種植試驗材料。田間種植采用隨機區(qū)組設計，2次重復，雙行區(qū)，行長6 m，行距0.67 m，株距24 m，25株/行，密度57 100株/公頃。開花時選擇生育期一致的植株掛牌，田間自然授粉，授粉后15 d開始取樣，取樣周期為每7天一次，每次取3穗，共取樣6批次。樣品自然風干后對籽粒進行水分、重量的測定，籽粒的重量以含水量13%折算。容重測定采用排水法，計算公式為：一定量籽粒重量/籽粒體積，用g·mL-1表示。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0軟件分析容重相關(guān)數(shù)據(jù)，利用KNAPP等[24]方法計算遺傳力。籽粒灌漿過程中容重相關(guān)QTL的檢測，利用覆蓋全基因組的822對SSR（simple sequence repeat，SSR）標記獲得親本間的多態(tài)性標記信息，通過WinQTLCart 2.5（Windows QTL Cartographer 2.5）軟件中的復合區(qū)間法完成，在0.05顯著水平進行1 000次模擬。檢測到QTL的命名以其所在的染色體為標準，同一染色體上的多個QTL位點表示為（Test weight）+染色體序號+位點序號（如a，b，c……）。

2 結(jié)果

2.1 玉米籽粒灌漿過程中容重的變化

農(nóng)大108及其親本籽粒灌漿不同時期容重變化表現(xiàn)隨籽粒灌漿進程推進逐漸增加的趨勢，但增加幅度不同，灌漿前期（尤其是DAP15到DAP22（days after pollination，DAP））容重增加較快，隨后增加幅度減少（表1）。2009年，安陽點農(nóng)大108容重從0.55增加至最終的1.13，許178容重從0.47增加至1.05，黃C容重從0.58增加至1.27，鄭州點農(nóng)大108容重從0.60增加至1.10，許178容重從0.50增加至1.31，黃C從0.61增加至1.16；2010年，安陽點農(nóng)大108容重從0.58增加至最終的1.16，許178容重從0.57增加至1.31，黃C容重從0.80增加至1.38，鄭州點農(nóng)大108容重從0.53增加至1.09，許178容重從0.47增加至1.22，黃C容重從0.64增加至1.20。不同年份間，容重在灌漿DAP22至DAP43期間表現(xiàn)出顯著的差異，但最終的容重在年份間差異較小，說明遺傳因素對最終的容重表現(xiàn)起決定作用。在籽粒灌漿不同時期，農(nóng)大108的容重表現(xiàn)多介于雙親之間，沒有出現(xiàn)超親優(yōu)勢情況，表現(xiàn)典型的加性效應（表1）。對RIL群體容重性狀進行測驗，發(fā)現(xiàn)在籽粒灌漿過程中，不同年份間RIL群體籽粒容重均存在顯著差異，而不同地點間籽粒容重的差異主要在籽粒起始灌漿期（DAP15，=-2.019*）和灌漿滯后期（DAP36，=-2.208*；DAP43，=-3.326*）（表2）。結(jié)果表明，氣候條件對容重的影響大于田間微環(huán)境對容重的影響。

表1 不同時期不同環(huán)境條件下F1及親本籽粒容重的統(tǒng)計

容重單位為mg·kernel-1；DAP表示授粉后天數(shù)。下同 The unit of test weight is mg·kernel-1; DAP represents day after pollination. The same as below

表2 RIL群體容重的t測驗

*表示0.05水平上顯著相關(guān) * indicates the significance level is≤ 0.05

2.2 玉米籽粒容重QTL分析

利用覆蓋玉米全基因組的822對SSR標記對親本黃C和許178進行多態(tài)性標記篩選，共獲得216對在親本和群體中表現(xiàn)較好的多態(tài)性SSR標記。利用這216對多態(tài)性標記對玉米籽粒灌漿不同時期容重的動態(tài)變化進行QTL分析，兩年4個試點6個取樣時期共檢測到31個容重相關(guān)QTLs，分布在玉米第1、2、3、5、6、7、8和9染色體上（表3和圖1），分別有2、4、5、3、4、5、3和3個QTL，都變現(xiàn)加性效應。31個QTL中有2個被重復檢測到，在2010年安陽試點DAP22和DAP36被檢測到，貢獻率分別為11.5%和14.7%；在2009年鄭州試點DAP29和DAP36被檢測到，貢獻率分別為22.2%和14.7%。在2009年鄭州試點DAP43被檢測到，是貢獻率（29.7%）最大的QTL；在2015年安陽試點DAP50被檢測到，是貢獻率最?。?.9%）的QTL。31個QTL中，有13個QTL的加性效應來自親本黃C（正值），18個QTL的加性效應來自親本許178（負值）；貢獻率在20%以上的QTL有5個，分別是。在籽粒灌漿不同時期檢測的容重QTL數(shù)目也有差異，DAP15有4個QTL，DAP22有8個QTL，DAP29有4個QTLs，DAP36有5個QTL，DAP43有5個QTL，DAP50有5個QTL。2個穩(wěn)定遺傳的主效QTL（和）均是在籽粒灌漿高峰期檢測到，同時也印證了籽粒灌漿過程中容重的變化規(guī)律，說明遺傳因素是決定籽粒容重的主要因素。因而，通過遺傳改良可以增加容重、提高產(chǎn)量，培育產(chǎn)量高、商品品質(zhì)好的優(yōu)良玉米雜交種。

表3 2009年和2010年玉米籽粒容重相關(guān)QTL

3 討論

玉米籽粒容重是復雜的數(shù)量性狀，對控制容重的QTL進行動態(tài)分析，在不同環(huán)境不同地點未檢測到穩(wěn)定表達的QTL，但檢測到2個影響容重動態(tài)變化的主效遺傳QTL，且貢獻率都在11%以上。造成不同于研究間容重QTL有較大差異的主要原因有2個，一是所用試驗材料遺傳背景的差異，不同遺傳背景下QTL的效應值不同；二是環(huán)境條件的影響，容重性狀是典型的數(shù)量性狀，環(huán)境條件與遺傳因素間存在互作，任何性狀的發(fā)育都有一組相關(guān)基因在時空上進行有序表達[25]，因此，在不同的環(huán)境不同生育時期導致不同QTL被檢測到的效率有很大差異。

圖1 玉米籽粒容重動態(tài)變化QTL在染色體上的分布

玉米籽粒中85%為胚乳，胚乳發(fā)育不良，籽粒充實度差，必然導致籽粒容重的降低。張麗等的研究表明玉米容重屬于物理性狀，與粒型、密度、硬度和水分含量等其他物理性狀之間也有密切關(guān)系，尤其是水分含量[13]。邵慧等[26]和韓英鵬等[27]研究了高水分小麥容重隨水分變化的規(guī)律，表明水分和容重成負相關(guān)關(guān)系，籽粒含水量越高，干物質(zhì)積累少，容重越低。因此在籽粒發(fā)育階段促進淀粉的合成與干物質(zhì)的積累，增加淀粉充實度，降低籽粒中的含水量有助于提高玉米的容重。本研究中，容重的大幅度波動發(fā)生在灌漿DAP22至DAP43期間，并且年份間波動不大，說明遺傳因素對容重的表現(xiàn)起決定作用。并且在DAP22至DAP43期間檢測到2個穩(wěn)定遺傳的主效QTL（和）同時也印證了籽粒灌漿過程中容重的變化規(guī)律，說明遺傳因素是決定籽粒容重的主要因素。因而，通過遺傳改良可以增加容重、提高產(chǎn)量，培育產(chǎn)量高、商品品質(zhì)好的優(yōu)良玉米雜交種。

在容重遺傳研究方面，Sun等[28]利用131個重組近交系在小麥的2A和5D染色體上定位到了粒寬、千粒重和容重的QTL群；Huang等[29]利用包含185個個體的雙單倍體群體對小麥重要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量進行了QTL分析，鑒定了5個容重性狀相關(guān)的QTL。Peng等[22]利用F2:3群體，通過2年3點的試驗數(shù)據(jù)共定位到4個與籽粒容重相關(guān)的QTL，其中只有位于第1染色體umc1298—bnlg1671標記之間的QTL在6個環(huán)境中都被檢測到，且表現(xiàn)為加性效應，能夠穩(wěn)定遺傳，其貢獻率為7%。根據(jù)Ding等[23]的結(jié)果不難看出，微效QTL間的上位性互作也是容重性狀的重要遺傳基礎，但這些QTL不能穩(wěn)定遺傳，很難克隆。本研究得到的影響容重動態(tài)變化的2個QTL是表現(xiàn)加性效應的主效QTL，且與影響容重的其他因素（如籽粒大小、粒重等性狀）QTL定位于相同的染色體區(qū)間，（bnlg1160—phi046）與相應IF2群體定位到的籽粒體積和粒重QTL重疊[30]，說明本研究定位的容重QTL是真實存在的遺傳因素決定的QTL。

4 結(jié)論

利用來源于雜交種農(nóng)大108的一套包含166個家系的RIL群體對籽粒容重進行動態(tài)QTL分析。籽粒灌漿不同時期容重變化表現(xiàn)隨籽粒灌漿進程推進逐漸增加的趨勢，灌漿前期容重增加較快，隨后增加幅度減少。2年4個試點6個時期的試驗中共檢測到31個容重QTL。其中有13個QTL的加性效應來自親本黃C（正值），18個QTL的加性效應來自親本許178（負值）。在31個容重QTL中，和在籽粒灌漿高峰期被重復檢測到，可以作為控制容重動態(tài)變化的主效QTL。一方面，這些主效QTL通過MAS（molecular assistance selection）可用于育種實踐。另一方面，這些主效QTL可用于籽粒容重或籽粒發(fā)育相關(guān)基因的克隆。因此，通過遺傳改良篩選容重高的，淘汰容重低的玉米品種，可以通過分子標記輔助育種提高選擇效率，進一步克隆控制相應容重動態(tài)變化的主效基因，培育出產(chǎn)量高、商品品質(zhì)好的優(yōu)良玉米新交種。

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[30] ZHANG Z H, WU X Y, SHI C N, WANG R N, LI S F, WANG Z H, LIU Z H, XUE Y D, TANG G L, TANG J H. Genetic dissection of the maize kernel development processvia conditional QTL mapping for three developing kernel relatedtraits in an immortalized F2population., 2016, 291: 437-454.

（責任編輯 李莉）

QTL analysis of test weight dynamic change in maize

XU Meng-meng1, QIN Yong-tian2, CHEN Yong-qiang1, ZHANG Zhan-hui1, TANG Ji-hua1, FU Zhi-yuan1

(1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2)

【Objective】Identifying the QTLs controlling test weight dynamic change during maize grain filling will benefit for gene cloning of the related key QTLs. 【Method】In 2009 and 2010, a set of RIL population with 166 inbred lines derived from hybrid Nongda108 (Xu178 crossed with Huang C) was planted in Zhengzhou and Anyang with randomized block design. The ear samples of recombinant inbred lines with the same silking date were hand-harvested performed by time-course harvesting on 15, 22, 29, 36, 43, and 50 days after pollination for test weight evaluation. Phenotypic analysis was performed using SPSS18.0 software. The 822 pairs of SSR covering the whole maize genome were used to detect the polymorphisms between the two parents. And, 216 SSR markers were selected for linkage map construction. With the linkage map, QTLs responsible for test weight were evaluated by composite interval mapping program in the WinCartQTL 2.5 software. 【Result】Test weight of Nongda108 and its two parents tended to be a slow-fast-slow pattern along with the grain filling process. Genetic factor showed predominant factor on test weight, while environmental factors mainly did their effects during the early and the late stages rather than the peak stage. Between two years, the test weight of DAP22-DAP43 showed a significant difference, but no significant difference at the last stage. The test weight of hybrid Nongda108 was among the two parents exhibiting typical additive effects within different developmental periods. Via time-related QTL analysis, 31 QTLs were detected for test weight of six sampling stages under four environments. These QTLs were located on all the 10 chromosomes of maize genome with exception of chromosomes 4 and 10. And, the 2, 4, 5, 3, 4, 5, 3, and 3 QTLs were distributed on chromosomes 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 and 9, respectively. Among them, additive effect of 13 QTLs was contributed by Huang C (+), while additive effect of another 18 QTLs was contributed by Xu178 (-). The contribution of single QTL varied from 5.9% to 29.7%.was detected at DAP22 and DAP36 with a contribution of 11.5% and 14.7% to test weight in Anyang in 2010.was detected on DAP29 and DAP36 with a contribution of 22.2% and 14.7% to test weight in Zhengzhou in 2009. 【Conclusion】Two conserved QTLs,andwere repeatedly detected at two sampling stages with more than 10% contribution to test weight. These two major QTLs are very important for cloning gene controlling test weight dynamic change.

maize; grain filling; test weight; QTL

2016-05-18；接受日期：2016-07-21

國家自然科學基金（91335205）、國家小麥玉米作物學重點實驗室開放課題“玉米胚乳淀粉粒大小候選基因的功能與利用途徑解析”（SKL2014ZH-09）

許蒙蒙，E-mail：hnndxumengmeng@163.com。通信作者付志遠，E-mail：fuzhiyuan2004@163.com