酶促反應分子馬達的研究進展

秦為為+孫樂樂+彭天歡+徐艷+高延靜+王文鋒+李迪

摘 要 傳統觀點認為酶促反應并不會影響酶本身的擴散運動。最近的研究表明，在酶促反應過程中，酶分子的擴散系數會增大，而且其增大強度具有底物依賴性，即隨著底物濃度的增加而增大。酶促反應分子馬達，是利用酶促反應過程中產生的能量驅動納米或微米級物體的運動。盡管在幾種不同的酶體系中的研究已經證實了酶在催化過程中的底物依賴性，但是造成酶擴散增強的原因至今仍不清楚。本文從酶促反應過程中酶自身擴散系數的變化、酶自身擴散系數變化的可能機理及其應用等3個方面，對酶在催化過程中的底物依賴性以及酶促分子馬達的研究進展進行了綜述。

關鍵詞 酶促反應； 擴散系數； 趨化性； 自驅動； 納米馬達； 綜述

20160318收稿；20160418接受

本文系國家自然科學基金（Nos.21227804，21373260，31371015），中國科學院青年創新促進會項目（No.2013174），口腔疾病研究國家重點實驗室開放課題項目（No.SKLOD2015OF05）資助

Email： lidi@sinap.ac.cn

1 引 言

眾所周知， 液體中的分子不停地做無規則的布朗運動。對于有催化活性的酶分子而言，在無底物存在時，在溶液中的運動模式為布朗運動；在底物存在時，酶可以催化底物轉化為產物，并釋放出能量。傳統觀點認為，底物轉化為產物所釋放的能量不會對酶分子本身造成干擾[1]。然而最近的研究表明，在催化反應過程中，大多數酶的擴散系數會增大，而且增大程度與底物濃度呈正相關，即酶分子可以利用酶促反應過程中底物轉化時釋放的能量驅動酶分子自身的運動。

馬達是指可以將某種形式的能量轉化成機械能，用于做功的一類機器[2]。實際上，生物體內也包含多種多樣的馬達，如肌球蛋白、動力蛋白和驅動蛋白，都是胞漿內的分子馬達，通過消耗能量分子（ATP）為馬達在特定軌道（如微管）上的運動提供能量。基于酶的生物馬達在細胞內高效而精確地行使著特殊的功能[3～6]，如DNA的合成和囊泡的轉運等。在更高層次上，生物體系中的馬達可以使細胞有方向性地朝著特定的化學物質或光運動[7，8]。在上述情況中，這些生物馬達的運動都是利用了酶促反應過程中底物轉化為產物所釋放的能量。酶是生物體內進行各種各樣化學反應的催化劑。鑒于酶分子的多樣性、高效性，以及酶分子可以利用酶促反應過程中底物轉化所釋放的能量進行自我驅動，因此可利用酶分子設計構建馬達，這將會極大地擴展和豐富驅動納米或微米馬達的方式[9]，為設計新型的化學刺激響應的自動藥物輸送系統開辟新型且多樣化的途徑。本文將圍繞酶促反應過程中酶擴散系數的增強及其在分子馬達構建等方面的研究與應用進行評述。

2 酶促反應過程中酶自身的擴散行為

2.1 酶促反應對酶分子自身擴散系數的影響

最近的研究表明，酶促反應過程中酶的擴散系數會隨底物濃度的增加而增大。2009年，Yu等[10]通過實驗證明，由DNA模板和相應的RNA聚合酶組成的復合物，在底物NTPs存在時擴散變快，而且該復合物有朝著底物NTPs濃度高的方向運動的趨勢，這是一種類似于細胞趨化性的行為（如圖1所示）。

隨后，賓夕法尼亞州立大學的Muddana等首次使用熒光相關光譜儀（FCS）在單分子水平上測到了酶促反應引起的脲酶擴散增強的行為（圖2），并用布朗動力學模擬計算了擴散系數達到相應增強程度所需的力（約12 pN）[11]。Muddana等對酶促反應引起的擴散系數增強機理給出了幾種可能的解釋。2015年，加州大學伯克利分校的Bustamante研究組對文獻[11]報道的酶的擴散增強行為進行了更加嚴密的論證與排除實驗。他們的研究發現，酶促反應過程中酶擴散系數的增強與反應熱相關。即僅有催化放熱反應的酶才會表現出擴散系數增大，且擴散系數的增大與反應速率呈線性關系（圖 3）[1]。酶促反應中酶分子擴散系數增強，表明酶分子可以利用底物轉化為產物過程中所釋放的能量進行自我驅動，所以需要重新考慮酶促反應可能對酶分子所產生的影響，這對更加深入地理解酶分子在催化過程中的一些行為具有極其重要的意義。

2.2 酶促反應過程中酶分子自身擴散增強的機理

最近的一系列研究成果表明，酶促反應中酶擴散系數的增強具有底物依賴性，但對于這種酶促反應引起的酶擴散系數增強的機理仍不清楚。2010年，Muddana等提出了幾種可能的機理來解釋脲酶在催化尿素分解過程中酶擴散增強的底物依賴性[11]。第一種導致脲酶擴散增強的可能機理是：酶促反應過程中產生的帶電產物在酶分子的周圍產生的不對稱的電場，引起了帶電的酶分子擴散的增強。具體而言，即脲酶在磷酸鹽緩沖液中催化尿素分解的產物NH+4比HCO 4離子的擴散系數大，所以當尿素分子被水解后，這些產物離子被釋放在酶分子的表面，由于NH+4的快速擴散而產生了一個局域電場，這個電場可以在極短時間內對酶施加pN數量級的電泳力，直至離子從雙電層擴散離開。但是要測量如此短時間內的力是非常困難的，所以作者用布朗動力學模擬對單個底物轉換時所產生的力進行了估算（圖4）。第二種可能的解釋是：尿素水解所引起了酶分子局部pH值升高，使得蛋白質（酶分子）表面電荷增加，蛋白蛋白以及蛋白平衡離子之間的相互作用增強。這些相互作用的增強使得脲酶的擴散系數增大。為了驗證局部pH值變化對酶分子擴散的影響，作者使用熒光染料SNARF1（其熒光壽命隨局部pH的變化而變化）對脲酶進行了標記。作者發現pH值變化所能引起的酶擴散系數的增加（5%）遠不及實驗中所觀察到的擴散系數增加比例（28%），這說明pH值增加即使可以引起脲酶擴散系數變化，也不是導致如此大幅度擴散增強的主要原因。最后，作者通過計算得出，由于尿素水解所引起的溶液局部溫度的升高約在μK數量級，所以幾乎可以忽略其對酶分子擴散系數變化的影響。

2013年，Sengupta等[5]又發現過氧化氫酶的擴散系數也隨著底物濃度的增加而增大，在排除了電荷、pH值變化、氣泡以及溶液局部溫度升高等因素對酶分子擴散增強的影響后，他們認為酶催過程中擴散系數變化的原因可能是酶分子瞬時局部溫度升高造成的[5]。同時，在微流控通道中，脲酶與過氧化氫酶都有向底物濃度高的方向擴散的趨勢，這是一種分子尺度上類似于生物體系中趨化性的行為。作者認為酶分子具有類似于趨化性的行為的主要原因是酶促反應中酶分子擴散系數增強的底物依賴性。底物依賴性使酶分子在底物濃度高的地方擴散快。因此，可以利用酶的“趨化性”控制酶分子的運動方向，這為納米或微米馬達的設計及定向藥物運輸提供了新思路。

2015年，Bustamante研究組提出酶促反應過程中酶分子擴散系數的增強與反應熱相關[1]，只有催化放熱反應的酶的擴散系數才會增大，且擴散系數的增加與反應速率呈線性相關。他們研究了4種酶，包括過氧化氫酶、尿素酶、堿性磷酸酶和磷酸丙糖異構酶，發現前3種催化放熱反應的酶，其擴散系數的增加與反應速率呈線性關系。磷酸丙糖異構酶催化磷酸丙糖異構體之間的構象轉化，反應放熱可以忽略，因此其擴散系數不依賴底物濃度，即反應速率。他們提出了一種全新的理論模型解釋酶促反應過程中酶擴散系數增強的機理，即“化聲效應”（Chemoacoustic effect）[1]（圖5）。催化位點不對稱的酶在催化反應后釋放的熱量使酶本身膨脹而發生形變，導致對酶溶劑界面產生壓力。溶劑除了通過聲波釋放部分能量，根據牛頓第三定律，溶劑還會對酶產生反作用力，使酶的質心發生位移。作者認為這種反應熱所引起的“化聲效應”可能才是酶促反應中酶擴散增強的根本原因。這顛覆了傳統上認為反應熱不會對酶分子造成干擾的觀點，也使我們認識到酶促放熱反應或許是通過“化聲效應”引起了酶分子的質心發生位移。這種反應熱驅動酶分子運動的全新視角表明，反應熱或許也會對酶分子的結構完整性及內部自由度產生影響。對酶促反應中酶擴散增強機制的深入研究，不僅有助于理解生物體內酶分子一些復雜的生物學行為（比如聚合酶的方向性），也為設計一些具有特殊功能的納米或微米馬達指明了新的方向。

3 酶促反應過程中酶自身的擴散增強的潛在應用

3.1 構建利用酶促反應供能的微馬達

近年來，利用催化反應供能的人造馬達模擬生物分子馬達和微生物的研究備受關注[12]，因為它們在納米尺度組裝[13]、微型機器人制造[14～16]、化學或生物化學傳感[17～21]等領域具有重要的潛在應用。此外，利用靶向運動的人造馬達可運輸藥物[22，23]，且比傳統的被動擴散方式具有極大的優勢，如速度快、用量少等。但是要真正實現在生物體真實環境中的應用，人造馬達必須滿足兩個條件：一是利用生物體液中存在或生物相容性好的物質提供能量，進行自我驅動，而不是依靠自電泳或離子擴散泳機制[24]； 第二，制造馬達的材料具有較好的生物相容性[23，25]。

酶分子是生物體中普遍存在的，并且可以高效催化轉化生物體內的化學物質，所以其生物相容性很好。研究表明，過氧化氫酶、脲酶等在催化底物反應時，自身的擴散系數隨底物的濃度的升高而增大。當酶與底物共存時，酶就成為一個利用化學反應供能的“分子馬達”，但是酶自身的攜帶能力有限。最近，牛津大學Dey等[12]提出了一個利用酶促反應為動力的微馬達模型（圖6）。他們分別將過氧化氫酶和脲酶連接聚苯乙烯微球表面，當這種表面包裹酶分子的微球在相應的底物存在時，擴散系數也會隨著底物濃度的升高而增大。同時，他們也證明了這種微馬達更傾向于酶底物存在的方向進行擴散運動。利用酶分子構建微型馬達具有極大的優勢：一方面酶分子具有較好的生物相容性，另一方面其擴散運動具有一定的趨向性。因此，如果酶分子具有較大的載體用于攜帶藥物，原理上能夠應用于定向藥物輸送。這種可以對特定化學信號響應的微型馬達可用于構建在生理環境下執行特定功能的多功能復合馬達。

3.2 酶的分離純化

從復雜的生物樣品中分離出具有生物活性的特定成分的研究具有重要意義。對于生物大分子的分離純化，通常采用較溫和的純化條件，以保證其活性。現有的一些非標記的分離技術主要依賴于被分離物質的物理性質，如形狀[26]、密度[27]、粘性[28]、介電常數[29]及擴散性質[30]等。因此，如果存在與待分離的目標物質物理性質相似的物質時，就很難保障分離效率。基于酶分子對其底物濃度梯度的趨向性，賓夕法尼亞州立大學的Cremer課題組[31]提出了一種自發的分離方法，可以從酶分子的混合物中分離出能夠催化某種特定底物的酶分子。如圖7所示，他們設計了具有2個進口和5個出口的微流控通道，一個進口用于通入含有了特定底物的緩沖液，另一個進口用于通入兩種帶有不同熒光標記的酶溶液。兩種溶液同時通入時發生層流，底物的擴散在通道中形成橫向的濃度梯度，由于能夠催化該底物的酶擴散變快，在通道中橫向分布變寬，表現出所謂的“趨化性”，最后在底物濃度高的一側的出口處，流出的可催化反應的酶的濃度高于無催化活性的酶。與其它非標記技術相比，趨化分離主要是基于有活性的酶分子擴散系數的底物濃度依賴性，是一種自發、簡單且對酶分子無損傷的分離方式。這種分離技術可以推廣應用于分離其它活性催化劑及活性極低或無活性的催化劑。

4 展 望

酶分子可以利用酶促反應過程中釋放的能量驅動自身發生運動，即自驅動。酶分子的自驅動作用對從生物轉運到酶分子驅動的納米或微米智能馬達的設計等方面的研究產生非常重要的影響。利用環境中底物催化所釋放的能量可實現微米或納米尺度物體的自驅動，通過底物轉化產生的能量驅動不對稱顆粒在微米或亞微米尺度物體的運動已多有報道。酶分子的自驅動能力、多樣性和高效性必將極大地擴展和豐富利用酶分子構建納米和微米馬達的新方法，為新型馬達的發展奠定了堅實的基礎。此外，如果將這些酶分子催化體系固定到界面上，產生的機械力將會轉移到周圍的液體，基于此可設計各種各樣的酶分子微型泵，用于藥物、小分子或膠體的運輸，而且可以很好地避免非酶類生物催化劑所引起的生物相容性差的問題。最后，利用酶分子的生物“趨化性”行為，還可以在酶分子各自的活性底物存在時，無標記且無損地對酶分子及其它活性催化劑進行分離。然而，將基于酶分子的人工合成馬達或泵真正用于生物體系中，實現特異性的、定點的分子傳送或藥物運輸，還存在巨大的挑戰，需要對激活機制、運動的精確控制、生物穩定性等因素進行嚴密評估。

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Abstract It is traditionally assumed that enzymatic reaction does not perturb the diffusion of an enzyme iteself. Recent studies have shown that the diffusivity of enzymed increased in a substratedependent manner during catalysis. Thus， the energy released during enzyme catalysis can be used to propel nanoscale objects， e.g. molecule motors driven by enzymatic reactions. Although the dependence of enzyme diffusion on substrate has been reported in several different enzyme systems， the precise origin of this phenomenon is still unknown yet. However， sevral possible mechainsms have been proposed for the enhanced diffusion. This review illustrates recent progresses in the research on the influences of enzymatic reaction on the diffusivity of enzyme， including the change of diffusion coefficient of enzymes， potential mechanisms and related applications.

Keywords Enzyme reaction； Diffusion coefficient； Chemotaxis； Selfpropelled； Nanomotor； Review