氨基雙四唑型金屬螯合磁性納米粒子的制備及其對蛋白質的吸附性能

單丙輝+王超展+衛引茂

摘 要 通過4步化學反應對磁性Fe3O4@SiO2納米粒子進行化學修飾，設計和制備了一種N，N′二（5四唑亞甲基）胺修飾的金屬螯合磁性納米粒子。用X射線光電子能譜（XPS）、Zeta電位對該新型吸附劑進行了表征。用靜態吸附法研究了螯合Cu吸附劑對溶菌酶、細胞色素C和α糜蛋白酶的吸附性能以及溶液pH值、鹽濃度、蛋白初始濃度對吸附量的影響。結果表明，吸附劑對蛋白質的吸附主要通過金屬配位機理進行，且符合Langmuir吸附模型，對溶菌酶、細胞色素C和α糜蛋白酶的最大吸附量分別20.0、13.5和17.9 mg/g。此外，將螯合Cu吸附劑用于混合蛋白質樣品的吸附，發現此吸附劑對混合蛋白質樣品中的溶菌酶具有選擇性吸附作用，說明此金屬螯合吸附劑在蛋白質選擇性分離富集中具有一定應用價值。

關鍵詞 磁性分離； 金屬螯合； 吸附劑； 蛋白質

20160225投稿；20160422接受

本文系國家自然科學基金（Nos. 21275115， 21475104， 21575114）和長江學者高校創新團隊項目 （No. IRT15R55） 資助

Email： ymwei@nwu.edu.cn

1 引 言

固定化金屬親和（IMAC）吸附劑在生物大分子分離和純化過程中應用廣泛。該類吸附劑一般由基質、金屬離子以及在二者之間起到鍵合連接作用的螯合配體組成。 傳統的基質有大孔硅膠、瓊脂糖、有機聚合物等，但這些基質存在傳質慢、分離操作困難等缺點。近年來，磁性材料因具有大的比表面積、超順磁性、低毒性、良好的生物相容性以及磁響應性高等特點[1]，作為吸附劑的基質在蛋白質等物質的分離純化中獲得了廣泛應用。配體的作用是將金屬離子固定在基質上，同時對分離選擇性有重要影響。迄今為止，文獻中已報道了多種配體，主要分為4種類型[2～5]： （1）二齒配體，如水楊醛，氨基異羥肟酸，8羥基喹啉； （2）三齒配體，如亞氨基二乙酸（IDA），磷酸絲氨酸，二甲基吡啶胺，羧甲基脯氨酸和N（2甲基吡啶）氨基乙酸； （3）四齒配體，包括次氮基三乙酸（NTA）和羧甲基化天冬氨酸； （4）五齒配體，如N，N′，N′三羧甲基乙二胺和四乙烯五胺。最近，文獻[6，7]報道了一種基于1，4，7三氮雜環壬烷的多齒配體，其在蛋白質分離中具有良好效果。這些配體絕大多數屬于氨羧型配體，其中三齒和四齒的螯合配體能同時兼顧與金屬離子穩定結合并使金屬離子留有足夠的空軌道固定蛋白質，實驗證明，這些配體更為適合作為IMAC材料的配基。

四唑基團的解離程度與羧基接近，且具有較好的穩定性[8]。在我們的前期研究中發現，四唑對金屬離子具有螯合作用[9]。本研究以四唑代替IDA中的羧基，設計一種不同于氨羧型配體的氨基四唑型三齒配體，采用四氧化三鐵（Fe3O4）磁性納米粒子為基質，制備一種新型金屬螯合吸附劑，并研究了固定Cu吸附劑對蛋白質的吸附性能。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV2550型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）； PHI5400 X射線光電子能譜儀（XPS， 美國PE公司）； Masterzeta 2000動態光散射儀（英國Malvern公司）； JY200C凝膠電泳儀（北京JUNYI公司）。

正硅酸乙酯（TEOS， 98%，上海晶純生化科技股份有限公司）； 4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷（95%，上海百靈威化學技術有限公司）； 三（2氨基乙基）胺和溴乙腈購自國藥集團化學試劑有限公司； 溶菌酶（Lysozyme， Lys）購于Amresco公司； 細胞色素C（Cytochrome C， CytC）、α糜蛋白酶（Chymotrypsin， αChy）購于LSBIO公司； 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA）購于Wolsen公司； 卵清蛋白（Ovalbumin， OVA）、肌紅蛋白（Myoglobin， Myo），購于Sigma公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 Fe3O4@SiO2的制備 參考文獻[10]和[11]制備。

2.2.2 Fe3O4@SiO2的修飾 將3.0 g Fe3O4粒子置于100 mL三頸瓶中，加入30 mL重蒸甲苯，超聲分散，逐滴加入0.75 mL 4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷，110℃下攪拌反應24 h。用甲苯、甲醇分別洗滌，40℃干燥。將干燥后的粒子、30 mL重蒸四氫呋喃（THF）、0.1 mL重蒸吡啶加入到100 mL三頸燒瓶中，再加入0.6 mL三（2氨基乙基）胺，65℃反應24 h得到氨基化Fe3O4@SiO2。向THF、甲醇、乙腈洗滌后的粒子中加入30 mL乙腈、2.43 g K2CO3作為縛酸劑、0.3 g KI作為催化劑和1.1 mL溴乙腈，80℃反應24 h，得到氰基化Fe3O4@SiO2。用乙腈、甲醇、N，N二甲基甲酰胺（DMF）分別洗滌所得粒子。最后，在粒子中加入30 mL DMF，0.63 g疊氮鈉和0.52 g氯化銨，120℃反應16 h。反應結束，用DMF、甲醇、蒸餾水分別洗滌，真空干燥，得到N，N′二（5四唑亞甲基）胺修飾的磁性納米粒子，即氨基雙四唑型磁性納米粒子。

稱取0.5000 g氨基雙四唑型粒子于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 5 mmol/L CuSO4溶液，25℃吸附12 h，在磁鐵吸附下除去上清液，再用少量pH 5.0， 0.1 mol/L乙酸乙酸鈉溶液清洗，除去未螯合的Cu， 真空干燥，即得到金屬螯合磁性納米粒子。其合成路線及吸附原理如圖 1所示。

2.2.3 蛋白質吸附研究 （1） 溶液pH值的影響 在放置10 mg吸附劑的50 mL離心管中，分別加入5 mL用0.2 mol/L NaCl配制的、不同pH值的0.3 mg/mL Lys、CytC和αChy溶液。將混合吸附劑的蛋白質溶液超聲分散1 min，并置于搖床振蕩，結果表明，25℃下1 h可以達到吸附平衡。磁鐵分離取上清液，用0.45 μm膜過濾，紫外分光光度計分別測定溶液的吸光度，計算平衡濃度，根據式（1）計算吸附量：

2.2.4 吸附劑的吸附選擇性 配制濃度分別為1 mg/mL的OVA， BSA， Lys和Myo混合溶液。取0.2000 g 吸附劑和2 mL混合液，25℃吸附1 h。收集上清液，吸附劑用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）清洗3次，再用1.0 mL 0.2 mol/L NaCl淋洗。然后，加入1 mL含0.5 mol/L NaCl和0.7 mol/L咪唑的緩沖液進行洗脫。收集該過程的上清液、淋洗液和洗脫液，用10%十八烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對溶液進行分析。

3 結果與討論

3.1 XPS表征

根據分子結構，四唑基團解離后形成的四唑環狀陰離子具有強的給電子能力，可充當配位基團。因此，本研究模擬金屬螯合吸附色譜中最常用的配體—亞氨基二乙酸結構，設計合成了一種氨基雙四唑型配體。該配體通過N和兩個四唑陰離子環與金屬配位，因此屬于三齒配體。

為了驗證氨基雙四唑型配體結構，用XPS表征了修飾過程中每種粒子的元素含量及其存在環境。從圖2可見，經4（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷修飾后出現Cl元素（1.68%， w/w）的特征峰。該粒子與三（2氨基乙基）胺反應后，Cl元素的特征峰消失，出現了N元素（2.57%）特征峰。對于氰基化粒子和氨基雙四唑型粒子，雖然元素的特征峰不變，但是N含量分別增加到4.57%和5.22%，說明粒子表面的氮元素增多，與配體的結構符合。為進一步確認四唑的形成，對四唑型吸附劑XPS測定的N元素進行了N1s分峰處理。可以分為結合能為402.39， 401.06， 400.25， 399.48和398.62 eV的5種N1s特征峰，其中398.62 eV對應于叔胺N原子，400.25 eV對應CNHC的特征峰，402.39， 401.06和399.48 eV屬于四唑環上N原子的特征峰[12]。N1s分峰結果表明，吸附劑表面有四唑基團生成。

氨基化的粒子由于強烈的質子化傾向，具有較大的Zeta電位值； 粒子表面接枝氰基后，質子化能力降低，Zeta電位值下降。經四唑基修飾后，四唑環在低pH值下發生部分解離變成負離子，故Zeta電位值繼續降低。當粒子螯合銅后，表面正電荷增多，導致不同pH值下的Zeta電位值均大于四唑基粒子。由圖3可知，在pH 2～9范圍內，Zeta電位的大小順序為：氨基化粒子>氰基化粒子>金屬螯合粒子>氨基雙四唑型粒子。隨著pH值增加，所有粒子的Zeta電位都呈下降趨勢，這是因為在溶液pH值增加的過程中，粒子表面質子化減弱，而表面殘存的硅羥基解離程度增大，使表面負電荷逐漸增多。吸附劑Zeta電位的變化證明了合成每步反應都是成功的。

3.3 吸附劑對蛋白質的吸附性能

3.3.1 溶液pH值的影響 由圖4可見，隨著pH值的升高，Lys， CytC和αChy的吸附量呈現不同的變化趨勢。Lys的吸附量隨pH值升高而呈現出整體上升的趨勢； CytC的吸附量在酸性溶液中保持不變，在堿性環境中增加。這符合金屬螯合吸附作用在中性和弱堿性溶液最大的特點[13]。但是，αChy的吸附卻呈現出隨pH增大而減小的趨勢。該現象與其分子結構有關：αChy表面有兩個裸露的組氨酸His57和His40，His57存在于催化三聯體中，僅起催化作用，His40作用面積較小，但空間取向較靈活，在金屬螯合吸附中可與金屬產生配位作用，從而使αChy在吸附劑表面產生吸附行為[14]，但可能由于靜電作用力參與程度較大的緣故，使蛋白吸附隨pH增大而減小。3種蛋白吸附量與金屬螯合色譜中Lys、CytC、αChy的保留時間隨pH變化趨勢一致[7]，也支持了蛋白與吸附劑之間存在螯合作用的機理。

3.3.2 鹽濃度的影響 當NaCl濃度小于0.4 mol/L時，3種蛋白吸附量均隨NaCl濃度的增加而降低； 當NaCl濃度大于0.4 mol/L時，Lys、CytC和αChy吸附量分別減小至8.90、5.08和10.73 mg/g； 繼續增大NaCl濃度，吸附量保持不變。這種現象與蛋白和吸附劑之間存在的配位和靜電作用有關。在低離子強度范圍內，隨著離子強度增加，吸附量明顯降低，反映蛋白質與吸附劑之間存在弱靜電作用； 當鹽濃度大于0.4 mol/L后，蛋白質與吸附劑之間靜電作用被完全屏蔽，蛋白質的吸附作用以配位作用為主。

3.3.3 吸附等溫線 蛋白質的吸附量隨著Lys、CytC、αChy的初始濃度增大而增大，在Lys， CytC和αChy初始濃度分別為0.7， 0.2和0.3 mg/mL時達到最大吸附量，蛋白質的初始濃度繼續增加，吸附量不再變化。分別用Langmuir和Freundlich模型對吸附數據進行擬合。由表1可見，3種蛋白質的吸附更符合Langmuir吸附等溫線，說明吸附劑對3種蛋白質的吸附是以單分子層吸附為主。這符合金屬螯合的吸附機理，即蛋白質與固定相表面的金屬離子活性位點配位，從而形成單分子吸附。另外，從Langmuir擬合，計算出Lys、CytC和αChy的最大吸附量分別為20.0 mg/g， 13.5 mg/g和17.9 mg/g。

3.4 混合蛋白質中Lys的分離提純

圖5為混合蛋白質純化前后的SDSPAGE凝膠電泳圖。與混合標準蛋白質電泳帶（泳道2）相比，當蛋白質被吸附后，上清液中僅包含BSA、OVA和Myo，不存在Lys，說明Lys被完全吸附。淋洗液中無蛋白條帶，但在洗脫液中只有Lys條帶，說明氨基雙四唑型吸附劑能從混合蛋白質中選擇性萃取出Lys。吸附劑對其它3種蛋白質均有吸附作用，但是對Lys的吸附作用更強，所以當它們混合后，Lys優先占據了吸附劑上的活性位點，其它蛋白質保留在上清液中。因此，吸附劑在蛋白質分離純化具有選擇性。

4 結 論

設計和制備了一種氨基雙四唑型金屬螯合磁性納米粒子吸附劑，并用XPS和Zeta電位對其結構進行表征。以pH效應和鹽效應驗證了螯合金屬Cu的吸附劑對蛋白質的吸附符合金屬螯合吸附機理。用吸附劑對混合蛋白質樣品進行萃取分離，證明了此吸附劑對蛋白質具有選擇性吸附能力，說明此吸附劑在蛋白質分離領域具有一定的應用價值。

References

1 CHEN Bo， LIU Chang， ZHAO XueSong， PAN XueJun. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（2）： 205-211

陳 波，劉 旸，趙雪松，潘學軍. 分析化學， 2016， 44（2）： 205-211

2 Pfaunmiller E L， Paulemond M L， Dupper C M， Hage D S. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405（7）： 2133-2145

3 Chaouk H， Hearn M T W. J. Chromatogr. A， 1999， 852（1）： 105-115

4 GabercPorekar V， Menart V. J. Biochem. Biophys. Methods， 2001， 49（13）： 335-360

5 Yao X P， Fu Z J， Zhao Y G， Wang L， Fang L Y， Shen H Y. Talanta， 2012， 97： 124-130

6 Mooney J T， Fredericks D， Hearn M T W. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（1）： 92-99

7 Petzold M， Coghlan C J， Hearn M T W. J. Chromatogr. A， 2014， 1351： 61-69

8 Lei G H， Xiong X H， Wei Y M， Zheng X H， Zheng J B. J. Chromatogr. A， 2008， 1187： 197-204

9 CHEN YouNing， GAO Li， HE MaoFang， WEI YinMao. Chem. J. Chinese Universities， 2014， 35（7）： 1596-1602

陳佑寧，高莉，賀茂芳，衛引茂. 高等學校化學學報， 2014， 35（7）： 1596-1602

10 Liu J， Sun Z K， Deng Y H， Zou Y， Li C Y， Guo X H， Xiong L Q， Gao Y， Li F Y， Zhao D Y. Angew. Chem. Int. Ed.， 2009， 48（32）： 5875-5879

11 Chen H， Deng C H， Zhang X M. Angew. Chem. Int. Ed.， 2010， 49（3）： 607-611

12 Kaminker R， Motiei L， Gulino A， Fragala I， Shimon L J W， Evmenenko G， Dutta P， Iron M A， Boom M E. J. Am. Ceram. Soc.， 2010， 132（41）： 14554-14561

13 LI Rong， DI ZeMei， CHEN GuoLiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2002， 30（5）： 552-555

李 蓉， 邸澤梅， 陳國亮. 分析化學， 2002， 30（5）： 552-555

14 Anspach F B. J. Chromatogr. A， 1994， 676（2）： 249-266

Abstract A bis（5methyltetrazolium）aminebonded magnetic nanoparticle adsorbent was prepared by chemically modifying magnetic nanoparticles Fe3O4@SiO2 via four steps chemical reactions. The physical properties of the adsorbent were characterized by Xray photoelectron spectroscopy （XPS） and Zeta potential. The static adsorption behavior of lysozyme， cytochrome C and chymotrypsin on the chelated Cu adsorbent， as well as the influences of the pH value of solution， ion strength and initial protein concentration on the adsorption capacity were evaluated with batch method. The results illustrated that the adsorption of protein proceeded via metal coordination mechanism and was also in accordance with Langmuir adsorption model， and the maximum adsorption capacities of lysozyme， cytochrome C and chymotrypsin were calculated to be 20.0 mg/g， 13.5 mg/g， and 17.9 mg/g， respectively. In addition， the chelated Cu adsorbent was employed to adsorb protein mixture， showing that this new type of adsorbent had selective adsorption to protein mixture. These results illustrated that the metalchelated adsorbent had potential application value in selectively separating and enriching proteins.

Keywords Magnetic separation； Immobilized metal ion affinity； Adsorbent； Protein