柱前衍生—酸誘導瞬時等速堆積柱上富集毛細管電泳法測定巰基化合物

黃征+張紅醫

摘要 建立了柱前衍生-酸誘導瞬時等速堆積柱上富集毛細管電泳測定巰基化合物的方法。在Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.15）中， 巰基化合物與2-氯-1-甲基碘化吡啶在室溫條件下反應10 min；隨后，將反應混合物引入到充滿40 mmol/L甲酸鹽背景電解質溶液（pH=3.96）的毛細管柱內；最后，向毛細管柱中引入適量稀H2SO4溶液。當在毛細管柱兩端施加正向電壓時，衍生的巰基化合物就會經瞬時等速堆積電泳過程而發生富集，其中前導和尾隨離子分別為H+和Tris+。以半胱氨酸和巰基乙酸為分析對象，檢測波長設為312 nm，優化了酸誘導瞬時等速堆積柱上富集的各種實驗條件。在最佳條件下，半胱氨酸和巰基乙酸的線性范圍分別為10～100 mg/L和4～100 mg/L，檢出限分別為0.2和0.4 mg/L。本方法用于脫毛膏中巰基乙酸的測定， 結果令人滿意。

關鍵詞 巰基化合物； 半胱氨酸； 巰基乙酸鈉； 柱前衍生； 柱上富集； 毛細管電泳

2015-12-28投稿；2016-04-22接受

本文系河北省自然科學基金（No. B2013201234）資助

E-mail： hyzhang@hbu.edu.cn

1 引 言

巰基化合物在生理學和病理學[1～6]、化工生產[7，8]和食品生產[9]等方面具有重要價值。對于缺少生色團的低分子量巰基化合物，在紫外區的摩爾吸光系數較小，其信號常被樣品中共存組分的吸收信號淹沒，因此檢測這類無生色團的巰基化合物通常采用色譜類方法將其與共存物分離后再檢測，諸如反相高效液相色譜[10，11]、毛細管電泳法（CE）[12]等。

毛細管電泳-紫外分析法（CE-UV）已用于化妝品中巰基乙酸的檢測[12]，但巰基乙酸常與其它成分相伴出現在電泳圖中，對巰基乙酸的測定會有一定程度的影響。金納米粒子可選擇性地與巰基化合物發生相互作用，所以經金納米懸浮液處理后，樣品中的巰基化合物可得到有效凈化，避免了共存組分對巰基化合物CE-UV檢測的干擾[13，14]。但該法吸附和解吸附巰基化合物均要耗時1 h以上。文獻報道了一種基于2-氯-1-甲基喹啉四氟硼酸鹽衍生反應的瞬時等速電泳測定巰基化合物的方法，但該試劑需自行合成并提純[15～17]。

本研究選擇巰基乙酸和半胱氨酸作為目標分子，將巰基化合物的柱前衍生和柱上富集毛細管電泳分離檢測結合，建立了巰基化合物的高靈敏度快速測定方法。2-氯-1-甲基碘化吡啶（CMPI）與巰基化合物可在室溫及pH=8.15的Tris-HCl緩沖溶液中快速反應[18]，該產物可與酸誘導柱上富集毛細管電泳方法相契合。巰基乙酸是脫毛膏化妝品的重要成分，利用本方法對脫毛膏樣品中巰基乙酸含量進行了測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳系統（Beckman， Fullerton， CA，USA）。紫外檢測器及32karat色譜工作站。石英毛細管（60.2 cm×75 μm ×10 cm，河北邯鄲瑞豐色譜配件廠）。紫外可見分光光度計（上海優尼柯公司）。

除2-氯-1-甲基碘化吡啶（CMPI， >98%，上海梯希愛化成工業發展有限公司）以外，其它試劑均為分析純。巰基乙酸鈉 （TGA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），L-半胱氨酸 （Cys，Amresco分裝）。脫毛膏購自本地超市。

2.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入2 mL Tris-HCl緩沖液（pH=8.15）、2 mL Cys和TGA混合標準溶液（或樣品溶液）、1 mL CMPI（10 mmol/L）溶液，然后渦旋30 s，并在室溫下放置10 min。該溶液供毛細管電泳分析使用。

0.25 g脫毛膏與10 mL水超聲提取15 min，依次經過離心、過膜、稀釋10倍處理后，進行上述衍生反應。

2.3 電泳條件及HPLC條件

毛細管柱在使用前，依次用0.1 mol/L HCl、蒸餾水、0.1 mmol/L NaOH和背景電解質沖洗。兩次運行間，分別用0.1 mol/L NaOH沖洗2 min和背景電解質沖洗4 min。分離電壓10 kV，檢測波長312 nm，溫度為25℃，運行緩沖溶液為40 mmol/L甲酸鹽溶液（pH=3.96）。壓力進樣（0.5 psi×20 s），誘導酸的導入（0.5 psi×11 s）。

HPLC條件： 色譜儀： LC-20A HPLC（Shimadzu， Japan）； 耐酸色譜柱： Diamonsil C18 HPLC柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，迪馬公司）； 流動相： 乙腈 + 0.01 mol/L KH2PO4（10∶90， V/V， pH 2.5）； 流速： 1.0 mL/min； 檢測波長： 215 nm； 柱溫： 30℃； 進樣量： 20 。

分 析 化 學第44卷

第7期黃 征等： 柱前衍生-酸誘導瞬時等速堆積柱上富集毛細管電泳法測定巰基化合物

3 結果與討論

3.1 衍生反應及檢測波長

CMPI與巰基化合物在弱堿性條件下反應生成硫醚類衍生物[19]。據此，TGA和Cys與CMPI存在如下化學反應：

圖1為TGA、Cys、衍生試劑CMPI、TGA-R+過量CMPI以及Cys-R+過量CMPI的紫外光譜圖（均以水為參比）。未經衍生反應處理的TGA和Cys，在200～400 nm范圍內沒有明顯吸收峰。衍生試劑CMPI在227和 272 nm附近存在明顯吸收。TGA-R+過量CMPI和Cys-R+過量CMPI分別有兩個吸收峰，分別位于227和312 nm附近，且衍生試劑和未衍生的TGA 和Cys三者均在312 nm沒有吸收信號。因此，最佳檢測波長為312 nm。

3.2 酸誘導柱上富集毛細管電泳條件優化

3.2.1 酸誘導柱上富集的流程 在樣品引入到毛細管柱前[20]或后[21～23]引入適量酸，是毛細管柱富集的兩種方式，為此考察了直接進樣（如圖2b）、先引入適量H2SO4再進樣（如圖2c）、以及先進樣再引入適量H2SO4（圖2a）3種情況下，TGA和Cys的分離情況。

由圖2a可見，通過酸誘導柱上富集， TGA和Cys被成功的分離富集。圖3給出這種富集過程的一般流程： 第一步（如圖3A），背景電解質充滿毛細管柱； 第二步（圖3B），壓力進樣法將Cys-R與TGA-R引入到毛細管中； 第三步（圖3C），壓力進樣法引入適量H2SO4； 第四步（圖3D），施加一定的電壓實現瞬時等速富集和分離； 第五步，瞬時等速和分離（圖3E）。由于H+的遷移速度快，可掃過樣品區帶，因此剩余的H+起到了前導電解質作用， 而被H+質子化的Tris+起尾隨電解質作用，衍生試劑、Cys-R、TGA-R的淌度均在二者之間，從而達到瞬時等速電泳的效果，實現柱上富集與分離。

3.2.2 酸的種類的影響 為了比較不同種類誘導酸的分離效果，分別選擇了150 mmol/L HCl， H3PO4和H2SO4作為誘導酸進行了實驗。由圖4可見，HCl和H3PO4作為誘導酸時，不能實現Cys-R與TGA-R的分離； 誘導酸為稀H2SO4時，可實現Cys-R與TGA-R的分離，且分離度有顯著提高。

由于誘導酸中H+移動速度快，所以可快速進入到樣品區發生中和反應。

過剩的H+既起到前導電解質的作用，又可降低樣品區的pH值，使分析物呈正電荷形式。誘導酸的緩沖容量和可提供的H+數量，是決定富集和分離的重要因素。本研究選擇稀H2SO4為誘導酸。

3.2.3 酸引入時間及酸濃度的影響 保持樣品進樣量（0.5 psi × 20 s）和分離電壓（10 kV）恒定，考察了稀H2SO4（150 mmol/L）的不同引入時間對分離度（R=2[t（TGA-R）-t（Cys-R）]/（W（TGA-R）+W（Cys-R）））的影響。當稀H2SO4引入時間在7.5～11.0 s內變化時，Cys-R與TGA-R兩峰的分離度隨酸引入量的增加而增大； 當稀H2SO4的引入時間在11.0～15.0 s內變化時，兩峰的分離度基本上保持不變。當酸引入時間較短時，滴定樣品區后過剩的H+也會使樣品區的酸度提高，但還不足以使兩分析物呈現完全質子化的形式； 隨著酸引入時間的進一步延長，樣品區酸度進一步加大，分析物呈完全質子化的形式，分離度達到最大。以下實驗稀H2SO4的引入時間均為11 s。

在其它分析條件保持不變的前提下，考察了誘導酸稀H2SO4濃度對分離度的影響。當H2SO4濃度小于130 mmol/L時，Cys-R與TGA-R的分離度為零； 當H2SO4濃度在130～180 mmol/L范圍內變化時，Cys-R與TGA-R分離度在2.0～2.5范圍內變化，且當H2SO4濃度為150 mmol/L時，兩峰的對稱性均很好。H2SO4濃度過低時，由于不能提供過剩的H+，不滿足柱上富集的條件； 而H2SO4濃度過高時，會增加中和反應的速度，加劇運行過程中熱量的產生，局部湍流而使峰展寬。因此，H2SO4濃度選擇為150 mmol/L。

3.3 方法評價和樣品測定

表1為TGA和Cys的線性范圍、檢出限及精密度等評價指標。以工作曲線法進行定量測定，校正峰面積（峰面積與遷移時間的比值，A/t）與分析物濃度TGA（4～100 mg/L）和Cys（10～100 mg/L）之間呈良好的線性關系（r=0.998），TGA和Cys的精密度在1.3%～4.8%之間，檢出限分別是0.4和0.2 mg/L。

應用本法測定了3種脫毛膏樣品中TGA，結果見表2。測得處理后的樣品溶液中TGA濃度在8.9～17.7 mg/L之間，折合為脫毛膏樣品中巰基乙酸鈣含量為1.2%，3.6%，2.7%，符合TGA含量小于5%的要求[24]。加標回收率在90%～104%之間。圖5A為應用本方法測定TGA和Cys標準混合物的電泳圖、脫毛膏的電泳圖及添加TGA后脫毛膏的電泳圖； 圖5B為按文獻[25]測定脫毛膏中TGA的HPLC圖。本方法分析時間短、電泳圖更簡單； 而HPLC法分析時間長，且TGA峰會受到共存物干擾而影響測定。這表明本方法在巰基化合物檢測方面具有一定的應用潛力。

4 結 論

建立了CMPI柱前衍生-酸誘導毛細管瞬時等速富集法測定巰基化合物的方法。本方法所選用的商用衍生試劑價格低、反應條件溫和、室溫下快速定量反應，衍生產物為陽離子，故易于與后續電泳條件相契合實現酸誘導柱上富集。本方法具有簡單、快速、準確等優點，可用于實際樣品的分析。

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Abstract A new method was developed for the determination of mercapto compounds by pre-column derivatization combined with acid-induced transient isotachophoretic stacking capillary electrophoresis. Mercapto compounds were derivatized with 2-chloro-1-methylpyridinium iodide （CMPI） in Tris-HCl buffer solution at pH 8.15 at room temperature. The derivatized mercapto compounds were introduced into the capillary filled up with 40 mmol/L formate buffer （pH=3.96）， followed by injection of diluted sulfuric acid. Upon application of voltage at normal polarity， the derivatized mercapto compounds were preconcentrated due to transient isotachophoresis stacking electrophoresis with H+ as the leading ion and Tris+ as the terminating ion. The detection wavelength was set at 312 nm. Cysteine and sodium thioglycolate were chosen as the models of mercapto compounds to be detected. Various experimental factors influencing transient isotachophoresis stacking were investigated. Under the optimal conditions， the linear relation between peak area and concentration was obtained in the range from 10 mg/L to 100 mg/L for cysteine， and from 4 mg/L to 100 mg/L for sodium thioglycolate. The LODs were 0.2 mg/L and 0.4 mg/L for cysteine and sodium thioglycolate， respectively. The developed method was successfully applied to the determination of thioglycolate in depilatory cream samples.

Keywords Mercapto compounds； Cysteine； Sodium thioglycolate； Pre-column derivation； On-column enrichment； Capillary electrophoresis