不同碳源促進污染水體氮素轉化的微生態過程

趙佩文，王 新，吳逸飛，姚曉紅，柳 永，孫 宏，葛向陽，湯江武，*

(1.華中農業大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

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不同碳源促進污染水體氮素轉化的微生態過程

趙佩文1，2，王 新2，吳逸飛2，姚曉紅2，柳 永2，孫 宏2，葛向陽1，湯江武2，*

(1.華中農業大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430070； 2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

在試驗條件下，向氮污染河道水體中C/N按15∶1補加甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉，檢測水體氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮的變化，以及在此過程中水體細菌胞外酶活性、細菌群落結構的變化。結果顯示，除甲醇、羧甲基纖維素鈉外，補加有機碳源顯著降低了水體氨氮的含量，水體β-葡萄糖苷酶活性在碳源補加后快速增加，補加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的水體中細菌群落結構明顯異于其他處理，表明添加有機碳源可顯著加快污染水體中氮素的轉化，水體微生物在此過程中起到關鍵作用。水體細菌群落結構和代謝活性對不同類型有機碳源有著不同的響應，因而添加不同有機碳源對水體氮素轉化具有不同的促進作用。

有機碳源；污染水體；細菌群落；PCR-DGGE；細菌代謝活性

隨著我國工業化進程的加快和現代農業的發展，水環境污染加劇，對污染水體的修復和治理也成為相關研究的重要領域。生物修復技術具有環境友好、生態節能的優點，是最具發展前景的水體原位修復技術，水體污染物的轉化、降解主要依賴微生物的作用，然而對于氮素污染水體而言，有機碳源的缺乏是水體氮素轉化、去除的主要限制性因素[1-4]。不同有機碳源用于污染水體的氮素去除在成本、環境效應上具有顯著的差異，不少研究人員開展了篩選適合不同水體環境修復有機碳源的研究，取得了較好的效果[5-9]。微生物對不同有機碳源有著不同的生態效應，補加碳源后微生物類群、群落結構、代謝活性等的變化必將對微生物強化修復產生重要的影響，然而迄今為止對于這個微生態過程尚缺乏了解。為此，以氮污染河道水體為研究對象，初步探索不同種類有機碳源補加對水體氮素轉化、去除的微生態過程的影響，旨在為污染水體微生物強化修復技術的優化、應用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 供試水樣及試驗方法

試驗用水樣采集自杭州市城郊河道，采樣時水體溫度26.3℃，pH值7.38，溶解氧含量2.37mg·L-1，水體氨氮含量8.20mg·L-1，總氮含量8.49mg·L-1，CODMn23.0mg·L-1，總磷0.33mg·L-1，TOC 7.24mg·L-1。水樣分裝在編號1—9的試驗水槽中，每個水槽裝入水量約200L。以試驗水樣中氨氮含量為基準，以15∶1的C/N將甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)等分別加入1—8號水槽中，各種試劑的總添加量依次為：甲醇 55.3mL，乙醇40.0mL，乙酸鈉 56.2g，檸檬酸鈉67.0g，葡萄糖45.1g，蔗糖 39.0g，麥芽糖41.0g，CMC-Na 41.4g，以9號作為空白對照，試驗環境溫度設置為24℃。河道中采集水樣的水質和微生物指標為各試驗槽的起始值，水樣的采集時間分別為12、24、48h。

1.2 β-葡萄糖苷酶活性的測定

水體中β-葡萄糖苷酶活性的測定采用熒光模擬底物法(fluorogenic model substrates，FMS)，參照文獻[10-11]改進后的測定方法進行。每個樣品均測定3個平行樣，以平均值表示該水樣中β-葡萄糖苷酶的活性。

1.3 細菌群落結構分析

1.3.1 水樣細菌總DNA的提取

采集50mL水樣，用0.22μm微孔濾膜過濾收集菌體，濾膜用鋁箔包裹，液氮速凍后存于-20℃冰箱備測。提取DNA時，將收集了大量菌體的濾膜剪成碎片，然后采用MOBIO PowerWater?DNA Isolation Kit，參照試劑盒附帶的操作步驟，提取樣品中的DNA，獲得的DNA用Nanodrop 2000檢測后，存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 基因片段的PCR擴增和DGGE分析

用于DGGE分析的片段為細菌16S rDNA V3區片段，所用引物為連有GC夾子的細菌341F和517R[12]，參考文獻[10-11]采用的方法，進行16S rDNA V3區片段的擴增和DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度40%～60%。電泳完成后，PAGE膠用EB染色并用天能凝膠成像系統獲取DGGE圖譜，經Quantity One-1-D軟件進行數字化分析后，用Matlab軟件進行矩陣和主成分分析。

1.3.3 主要細菌種類的測序分析

對DGGE凝膠中的主要條帶進行切膠、PCR回收、克隆轉化，獲得載有16S rDNA V3區基因片段的陽性克隆，每個條帶獲得的陽性克隆隨機挑選3個進行測序分析。獲得的序列結果在GenBank中進行BLAST分析，選取相似序列，用MEGA 4.1軟件進行比對后，以Neighbor-Joining法構建主要細菌種類的系統發育樹。

1.4 分析方法

水樣中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮含量的測定，均采用對應國家標準進行，分別為HJ 536—2009、HJ/T 197—2005、HJ/T 346—2007、HJ 636—2012。水樣中TOC的測定采用耶拿N/C 3100型總有機碳測定儀，參照儀器提供的方法進行測定，均測定3個平行。

1.5 數據統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(one way ANOVA)，對有顯著差異的各處理采用Tukey法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 水體總有機碳和氮素含量的變化

有機碳源的加入，使得試驗水體的總有機碳含量與對照組相比增加了15倍左右。在水體土著微生物的作用下，隨時間延長，總有機碳含量逐漸降低，其中，添加CMC-Na的試驗水體中，微生物對總有機碳利用能力較差(圖1)。

添加有機碳源后，各處理的水體氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮均發生了變化。不同有機碳源對氨氮的變化有著不同的影響，相較于對照組，除了添加甲醇、CMC-Na的試驗水體外，氨氮含量在有機碳源添加之后均呈顯著下降趨勢，但降至一定值之后呈平穩趨勢。添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的試驗水體中，氨氮含量在12h后迅速從8.2mg·L-1降低至3.2mg·L-1以下，去除率超過60%，顯著優于添加其他碳源的試驗水體(圖1)。和氨氮含量的變化趨勢相反，各試驗水體中亞硝酸鹽的含量在添加有機碳源12h后迅速升到高點，然后呈下降趨勢(圖1)。添加不同種類碳源對水體硝酸鹽含量變化的影響不同，添加乙酸鈉、葡萄糖、麥芽糖處理的水體中硝酸鹽的含量在12h內顯著升高，在12—24h呈下降趨勢，但在24h后與添加其他各類碳源的處理一樣呈升高趨勢(圖1)。相較于對照組，添加有機碳源的各試驗水體中總氮含量均呈顯著的下降趨勢，其中，加入乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖的水體中48h后總氮去除率為19.0%～21.3%，顯著高于其他處理(圖1)。

圖1 添加有機碳源后試驗水體中總有機碳、氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮含量的變化Fig.1 Variation of total organic carbon，ammonia，nitrite，nitrate，total nitrogen in experimental waters after addition of different organic carbon

2.2 水體β-葡萄糖苷酶活性的變化

β-葡萄糖苷酶是水體細菌轉化、利用碳源的關鍵胞外酶，是細菌生態活性和功能的重要指標。試驗水體中添加檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖之后，β-葡萄糖苷酶活性相較于對照組顯著上升，添加其他碳源的水體中的β-葡萄糖苷酶活性在12h之后開始顯著上升，在24h達到高點后開始下降，其中添加檸檬酸鈉的水體中β-葡萄糖苷酶活性在24h最高，達2.73μmol·L-1·h-1。上述結果表明，補加的有機碳源對水體中細菌活性有明顯的促進作用，其中，尤以添加檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖對水體β-葡萄糖苷酶活性的促進效果為好(圖2)。

2.3 水體細菌群落結構的變化

應用PCR-DGGE技術分析添加有機碳源后水體細菌群落結構的變化，圖3泳道中的不同條帶表示不同種細菌OTU，條帶亮度的變化可一定程度反映出不同細菌OTU的量的變化。可以看出，從添加碳源后12h開始，細菌群落即發生變化。主成分分析結果在二維圖中客觀顯示了細菌群落結構的變化，添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖顯著影響水體細菌群落結構，與其他處理差異明顯。外源有機碳源加入一段時間之后，水體中細菌群落處于相對穩定的狀態(圖4)。對DGGE圖譜中的主要條帶進行切膠回收、克隆、測序，通過系統發育分析顯示試驗水體中細菌的主要種類和多樣性(圖5)，代表不同細菌OTU的條帶在不同采樣時間的變化，是不同種類細菌對水體環境條件，尤其是碳源加入響應的結果。

圖2 添加有機碳源后試驗水體中葡萄糖苷酶活性的變化Fig.2 Variation of β-D-glucosidase activity in experimental waters after addition of different organic carbon

C為對照，泳道上方數字1—8代表添加碳源分別為甲醇、乙醇、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和CMC-Na；泳道標記的連字符后數字1、2、3分別代表12、24、48h取樣。C-0為初始對照。圖4同。C，Control; 1-8in front of each line represented methanol，ethanol，sodium acetate，sodium citrate，glucose，sucrose，maltose，and CMC-Na，respectively.The number 1，2，3followed by “-” represented sample time of 12，24，48h.C-0were initial samples of control.The same as in Fig.4

通過分析發現，尚未能培養的一株γ-proteobacterium細菌(圖3中Band 5)對葡萄糖、果糖、麥芽糖較為敏感，該菌在添加葡萄糖、果糖、麥芽糖48h后在細菌群落中的豐富度分別為28.5%、39.1%和42.0%。分別屬于Flavobacterium (圖3中Band 1)、Acinetobacter(圖3中Band 2、Band 4)的細菌則可能對醇類和有機酸鹽類比較敏感，屬于Flavobacterium(圖3中Band 1)的細菌在添加乙醇和乙酸鈉48h后在細菌群落中的豐富度分別為30.4%和29.9%。

圖4 添加有機碳源后水體中細菌群落結構變化的PCA分析結果Fig.4 PCA of bacterial community structure based on DGGE profiles

圖5 試驗水體中主要菌群的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of main bacteria in experimental waters

3 討論

長期以來，人類生產和生活產生的活性氮大量向水體釋放，已經遠遠超出水體氮的生物地球化學循環的載荷，使地表水氮素累積，引起富營養化。氨氮是最易流失于水體的氮素，且由于氨氧化過程的限制，易于在水體積累，是影響水體水質的主要污染物。自然水體中氮的循環受限于氨氧化和反硝化兩個過程，主要依賴微生物的作用[1，13]。由于氨氮在多數污染水體中的積累，使得水體C/N較低，嚴重影響微生物對水體氮素的利用和轉化。因此，在水體生物修復體系中，添加有機碳源是一種重要的促進氮循環的方式。當前研究和應用中，常用于補充碳源的有碳含量較高的污水[3，14-15]、低分子碳水化合物[2，16-17]和天然有機質[6，9，18-19]等。本研究中選用的有機碳源是常見的低分子碳水化合物，添加有機碳源后可顯著加快污染水體中氮素的轉化，但不同種類的有機碳源影響氮素轉化的效率不同，其中，添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖后，氨氮去除率超過60%，總氮去除率在19.0%～21.3%之間。以氮素轉化的關鍵步驟——氨氮的變化為例，添加葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對氨氮去除效果明顯，盡管在氨氮含量降低的同時，亞硝酸鹽含量升高，總氮含量降低，但從數量的變化來看，添加有機碳源后氨氮的轉化中同化作用占主導地位。這表明水體中微生物對有機碳源利用的選擇性是導致不同水體氮素含量變化差異的主要原因。

水環境中微生物對溶解有機物的轉化、利用需要經過細菌胞外酶的作用，因而細菌胞外酶活性是水體細菌的活性和功能的重要指標，是一個重要的水環境生態參數[10-11]。由于環境中微生物的群體屬性，細菌胞外酶活性的變化也是細菌群落結構和功能變化的外在表現。添加有機碳源之后，試驗水體中的β-葡萄糖苷酶活性快速升高，意味著微生物活性快速升高，24h后隨著可利用碳源的消耗，β-葡萄糖苷酶活性逐漸降低。水體中氮素變化的過程與β-葡萄糖苷酶活性的變化也有著一定的對應關系，這也可以進一步證實，添加的有機碳源促進了水體中微生物的變化，進而影響水體氮素的變化。

水體微生物在氮素轉化過程中起到關鍵作用，其功能變化與群落結構的變化是相適應的。有機碳源的添加是一個改變水體微生物群落結構和功能的關鍵因素，進而引發不同的生態效應。本研究結果表明，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對水體中細菌群落結構的影響與其他有機碳源有明顯差異，這種差異可能是水體中微生物對不同類型有機碳源利用的選擇性所致。DGGE圖譜中不同的優勢條帶代表不同種對環境變化響應的優勢細菌，如試驗水體中尚未能培養的一株γ-proteobacterium細菌，對葡萄糖、果糖、麥芽糖較為敏感，而分別屬于Flavobacterium、Acinetobacter的細菌則可能對醇類和有機酸鹽類比較敏感，這些細菌在整個群落的結構和功能變化中起到重要作用。這表明，水體中可能存在許多尚未發現的選擇性利用碳源的微生物，而這些微生物在一定的有利因素下具有較好的氮素轉化、去除的作用。本研究中添加有機碳源影響水體氮素轉化和細菌群落變化的過程，事實上就是碳源促進某類微生物生長，導致水體微生物群落結構和功能發生變化，從而快速轉化氮素的過程。

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(責任編輯 高 峻)

Microbial ecological process of nitrogen transformation accelerated by different organic carbon in polluted water

ZHAO Pei-wen1，2，WANG Xin2，WU Yi-fei2，YAO Xiao-hong2，LIU Yong2，SUN Hong2，GE Xiang-yang1，TANG Jiang-wu2，*

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China; 2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalScience，Hangzhou310021，China)

In the present study，methanol，ethanol，sodium acetate，sodium citrate，glucose，sucrose，maltose，and CMC-Na was added in nitrogen-polluted urban river water with C/N of 15∶1.Variation of ammonia，nitrite，nitrate，total nitrogen were detected by national standard method，β-glucosidase activity were determined using the fluorogenic model substrates，and the change of bacterial community structure were analyzed by PCR-DGGE.It was shown that contents of ammonia decreased significantly after organic carbon sources addition except methanol or CMC-Na.Addition of organic carbon sources increased β-glucosidase activity.Bacterial community structure differed obviously with addition of glucose，sucrose and maltose.The results indicated that addition of organic carbon could accelerate transformation of nitrogen in the nitrogen-polluted water，in which microbes played key role.Bacterial community and metabolic activity had different responses to varied organic carbons，which would lead to different strength on nitrogen transformation acceleration.

organic carbon; polluted water; bacterial community; PCR-DGGE; bacterial metabolic activity

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.17

2016-03-14

浙江省公益技術應用研究項目(2015C33046)；浙江省重大科技專項重點社發項目(2015C03004)；浙江省農科院創新提升工程項目；溫州市水體污染控制與治理科技創新項目(S20140021)

趙佩文(1991—)，女，湖北武漢人，碩士研究生，主要研究方向為微生物生態學。E-mail: 332726781@qq.com

*通信作者，湯江武，E-mail: tangjiangwu@sina.com

Q938.1

A

1004-1524(2016)11-1915-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1915-1921

http://www.zjnyxb.cn趙佩文，王新，吳逸飛，等.不同碳源促進污染水體氮素轉化的微生態過程[J].浙江農業學報，2016，28(11)： 1915-1921.