用靜電紡絲制備PCL/明膠新型組織工程支架用于人鼻中隔軟骨修復研究

范潔　李巖　周蘇波　徐宏宇

用靜電紡絲制備PCL/明膠新型組織工程支架用于人鼻中隔軟骨修復研究

范潔李巖周蘇波徐宏宇

目的 用靜電紡絲技術制備聚己內酯（PCL）/明膠生物活性支架，評價其相關理化性能及組織安全性，為今后靜電紡絲生物活性支架進一步用于鼻中隔軟骨組織工程修復提供研究基礎。方法 運用靜電紡絲制備PCL/明膠生物活性支架。掃描電子顯微鏡觀察纖維膜表面形貌、接觸角測量儀測定接觸角、萬能試驗機測量纖維力學性能、與人鼻中隔軟骨細胞共培養后MTT試驗檢測組織相容性。結果 所制備的PCL/明膠電紡支架表面光滑、分布均勻、直徑范圍200～1100nm，平均接觸角（75.32±3.58）°，平均拉伸強度（4.21±0.38）Mpa，平均彈性模量（11.04±2.53）Mpa。MTT顯示具有良好組織相容性。結論 作為一種新型支架材料，采用靜電紡絲制備PCL/明膠電紡支架在組織工程領域有進一步的應用前景。

聚己內酯 靜電紡絲 鼻中隔軟骨細胞 組織工程支架

鼻中隔軟骨主要為透明軟骨，具有多向分化潛能與自我復制能力，可以同種異體移植并且易于獲得使其成為良好的種子細胞。細胞外基質（ECM）復雜的網架結構，支持并連接組織結構，具有仿生結構制造的人工支架具有天然ECM的特點。通過靜電紡絲技術制備的生物活性支架結構類似于天然ECM［1］。將天然高分子材料明膠加入至聚己內酯（PCL）溶液中，在滿足其力學性能的同時，能夠顯著提高靜電紡絲支架的生物安全性和組織親合性［2］。本研究選擇靜電紡絲方法制備PCL/明膠生物活性支架，在此基礎上檢測纖維的微觀形貌、接觸角以及力學性能等理化性能，以及其對鼻中隔軟骨細胞的組織安全性，為今后靜電紡絲生物活性支架進一步用于鼻中隔軟骨組織工程修復提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料 PCL（分子量8萬，viscosity=0.81dl/g，濟南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷（AR，北京市通廣精細化工公司）；N，N-二甲基甲酰胺（AR，國藥集團試劑有限公司）。

1.2設備與儀器 TL-01型靜電紡絲設備（深圳市通力微納科技有限公司）。掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi，日本）；DHG-9420電熱真空干燥箱（上海海向儀器設備廠），EASY DROP K100型接觸角測試儀（KRUSS，德國）。

1.3靜電紡絲液的配制 根據以往文獻回顧及之前的預實驗，確定適宜的電紡溶液參數。觀察組：PCL/明膠組。將PCL與明膠以1∶1的比例共同溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）混合溶劑（v/v=8∶2）。配制成8% wt的靜電紡絲溶液，磁力攪拌4h后超聲脫氣10min。對照組：PCL組，將PCL溶于二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺混合溶劑（v/v=8∶2）。配制成10% wt的靜電紡絲溶液，磁力攪拌4h后超聲脫氣10min。

1.4生物活性支架的制備 將上述紡絲液分別加入10ml注射器，連接21G不銹鋼噴頭，設定噴頭與接收板之間距離為15cm，以電壓12kV，流速1.0ml/h為條件進行電紡。所制得的樣品真空干燥24h排出殘留有機溶劑。

1.5PCL/明膠生物活性支架的表征 將兩組制備的電紡纖維樣品噴金后使用掃描電鏡（SEM）觀察纖維形貌。測量電鏡照片中的纖維直徑，隨機選取50根纖維計算平均直徑和分布范圍。

1.6接觸角測量 將兩組纖維膜分別剪成40 mm×10mm長條狀，平整固定于載玻片上，使用接觸角測試儀測量生物活性支架接觸角，液體為甘油，在支架不同位置反復測量5次，取平均值［5］。

1.7電紡生物活性支架的力學性能 將厚度約為100 μm的電紡支架裁剪成最窄處10mm的啞鈴形樣條，在試驗機上進行拉伸試驗。計算得到各組纖維膜的拉伸強度、楊氏模量以及斷裂伸長率的平均值。

1.8電紡生物活性支架的組織相容性 制備的兩組電紡支架用專用打孔機裁剪成直徑為12mm的圓形，Co60輻照消毒，平鋪于24孔板底部，將鼻中隔軟骨細胞消化后制成1×104/ml細胞懸液，每孔添加500μl。支架在5%CO2、37℃、100%濕度與細胞復合培養1、3、5、7d后分別向每孔中加入MTT溶液（5mg/ ml）50μl，37℃孵育4h，棄上清液。每孔加入500μl DMSO，搖床低速振蕩10min。使用酶標儀測定490nm處的吸光值。所得OD值取平均值，細胞活力=觀察組OD值/對照組OD值×100%［3］。

1.9統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1電紡支架的表征 掃描電子顯微鏡下觀察到PCL/明膠電紡支架直徑均勻，纖維方向隨機分別并相互交錯成網狀，各組纖維表面光滑，無串珠及其他缺陷（見圖1）。所測得纖維直徑如圖2所示。圖中可見，PCL/明膠組纖維直徑小于PCL組（P＜0.05），PCL纖維直徑主要分布在200～1200nm之間，而PCL/明膠纖維直徑主要分布在200～600nm之間，可知PCL纖維直徑分布寬于PCL/明膠纖維。

圖1　兩組支架的SEM照片（左為觀察組，右為對照組）

圖2　相同參數下兩組纖維直徑

2.2電紡支架的接觸角 用接觸角測量儀所測得各組纖維接觸角圖片見圖3，PCL/明膠組平均接觸角（75.32±3.58）°，PCL組平均接觸角（114.89±6.25）°，結果顯示PCL/明膠組纖維的接觸角顯著小于PCL組（P＜0.05）。

2.3電紡支架的力學性能 兩組纖維膜的力學性能見表1。

表1　兩組纖維膜的力學性能（±s）

表1　兩組纖維膜的力學性能（±s）

注：與PCL組比較，*P＜0.05

組別拉伸強度（MPa）彈性模量（MPa）斷裂伸長率（%）PCL/明膠組4.21±0.38*11.04±2.53*40.14±2.69* PCL組6.69±0.5518.22±2.8630.17±1.13

2.4鼻中隔軟骨細胞與電紡生物活性支架的組織相容性 鼻中隔軟骨細胞在兩組電紡纖維膜表面均可貼附牢固，生長狀態良好。MTT檢測中，鼻中隔軟骨細胞與兩組纖維膜共同培養1、3、5、7d后，如圖4所示，各組吸光度均隨時間增加而增大，各時間點吸光度差異均有統計學意義（P＜0.05）。而在每個時間點，PCL/明膠組吸光度均大于PCL組（P＜0.05）。

圖3　兩組支架的接觸角（左為觀察組 右為對照組）

圖4　鼻中隔軟骨細胞在兩組支架上的增值情況

3　討論

ECM調節細胞形態和功能如粘附、增殖和分化［4］。具有合適力學性能的3D結構生物活性支架最大限度模擬ECM。靜電紡絲技術制備的納米纖維支架有比表面積高、孔隙率大的特點，利于營養物質和代謝產物的輸送［5］。眾多學者成功運用靜電紡絲技術制備出有生物活性的組成工程支架，并在體外進行細胞培養，均取得良好效果［6-7］。

PCL是一種人工合成半結晶性高分子，具有良好溶解性，能溶于各種有機溶劑中，并且具有易與其他高分子聚合物共混互溶等特性，使其成為常用的生物醫用材料。膠原蛋白是天然高分子聚合物［8］，可以模仿與膠原聯合應用，制備混合溶液進行電紡，既滿足了支架的力學性能，又能提高支架的生物活性，利于種子細胞的生長。

本研究旨在制備PCL/明膠靜電紡絲生物活性支架，電紡的過程以及支架的形態取決于多種因素的相互作用，包括所用溶劑的介電性能、液體的推注速度、電壓、接收距離等。SEM照片可以直觀觀察支架的形貌及直徑的變化，本實驗中PCL/明膠組纖維的直徑小于PCL組。同時，PCL/明膠組的直徑分布比PCL組更寬。其可能的原因是由于明膠的引入，一定程度上改變電紡絲溶液的導電性和粘度，改善了電紡條件，使制備的支架纖維直徑減小。而天然高分子材料的分子量差別較大，使電紡過程中溶液細流的鞭動不穩定，導致了部分纖維的溶并，使纖維直徑的分布變寬。

接觸角反映了纖維最初的親水性。靜電紡絲生物活性支架的親水性能是影響支架與種子細胞間最初相互行為的關鍵因素，其能夠直接影響到細胞的生存和繁殖能力。兩組接觸角不同的原因，是由于膠原的親水性優于PCL，膠原與PCL的混紡支架憑借膠原的存在，使接觸角小于PCL支架。

觀察組PCL/膠原支架的力學強度與PCL組相比有一定降低，與此同時斷裂伸長率由30%提升至40%。這可能是由于膠原的機械強度不如PCL，但特征粘度系數卻比PCL高的原因。兩組纖維均具有合適的力學性能，能滿足組織工程的需要。PCL/明膠支架改善了PCL的拉伸性能，其性能處于軟骨組織工程需要的范圍內。良好的組織相容性是組織工程材料的基本要求［9］。本實驗中鼻中隔軟骨細胞與兩組電紡支架復合培養3d后SEM觀察顯示，細胞呈多角形并向孔內生長。MTT結果顯示，隨著天然高分子材料明膠的加入，顯著提高了PCL電紡支架與鼻中隔軟骨細胞的親合性，使細胞更易于附著和增殖。

綜上所述，本實驗成功制備了具有生物活性的PCL/明膠電紡支架，并驗證了其與鼻中隔軟骨細胞的組織相容性，為今后將其在組織工程中應用修復軟骨缺損提供了研究基礎。

［1］許慶蕾.原位聚合靜電紡絲芯層乙撐二氧噻吩制備電活性復合材料. 天津大學, 2009.

［2］賈列妮,徐宏宇,華菲,等.靜電紡絲法制備載鹽酸多西環素GTR/GBR膜的結構和體外抑菌性能研究.臨床口腔醫學雜志, 2015, 31(9):515-518.

［3］陳若華, 蒲瑾, 戴焱焱, 等. 海芒果種子提取物nerifolin對人肝癌細胞系HepG2增殖和凋亡的影響.中國腫瘤生物治療雜志, 2011, 18(1):51-54.

［4］Bermueller C, Schwarz S, Elsaesser A F, et al. Marine collagen scaffolds for nasal cartilage repair:prevention of nasal septal perforations in a new orthotopic rat model using tissue engineering techniques. Tissue Engineering Part A, 2013, 19(19-20): 2201-2214.

［5］鄔麗麗. PLGA/殼聚糖電紡復合膜用于人工皮膚的研究. 天津大學, 2007.

［6］李德保, 章慶國. 軟骨組織工程支架材料研究進展.中國美容醫學, 2009, 18(3):408-410.

［7］楊亞軍. CDMP1誘導ADSCs修復軟骨損傷的實驗研究. 第四軍醫大學, 2008.

［8］Shi DH, Cai DZ, Zhou CR, et al. Development and potential of a biomimetic chitosan/type II collagen scaffold for cartilage tissue engineering. Chin Med J(Engl), 2005, 118(17):1436-1443.

［9］Kharlamova AS, Barabanov VM, Savel'Ev SV. Immunohistochemical study of human fetal vomerona structures the nasal septum, by applying neuron-specific beta3-tubulin antibodies. Arkh Patol, 2011, 73(2): 18-22.

Objective To prepare a novel Polycaprolactone（PCL）/ Gelatin（GE）bioactive scaffolds by electrospinning，evaluate PCL/GE fi ber morphology；related properties and biocompatibility，we provided the basis for scaffold on tissue engineering. Methods By using the technology of electrospinning，bioactive scaffolds with PCL/GE. Then we observed the morphologyo，investigated hydrophilicity and measured the mechanical properties of the fi bers. And then human nasal septum cartilage cells were seeded on bioactive scaffolds to study their capacity to support stem cell attachment and proliferation by MTT. Results The bioactive scaffold fiber diameter was evenly distributed and the surface of fibers was smooth. The diameter，the hydrophilic absorption and the mechanical properties were different from scaffold with PCL. Conclusions The PCI/GE bioactive scaffolds can be prepared；at the same time the scaffolds indicate the well prospects on the fi eld of tissue engineering.

Polycaprolactone Electrospinning Nasal septum cartilage cell Tissue engineering scaffold

315040 中國人民解放軍第113醫院耳鼻喉科