CCL25/CCR9在潰瘍性結腸炎中的表達研究

鐘萬鍔　曹萍　許晶飛

CCL25/CCR9在潰瘍性結腸炎中的表達研究

鐘萬鍔曹萍許晶飛

目的 研究趨化因子CCL25，CCL25的受體CCR9在潰瘍性結腸炎（UC）中的表達情況以及與UC病變程度和范圍的關系及相關性，探討其在UC發病機制中的作用。方法 用免疫組織化學法檢測32例活動期UC及22例正常對照石蠟包埋組織中CCL25及CCR9的表達情況。結果 UC組CCL25及CCR9均為陽性表達。對照組為陰性或弱陽性表達。CCL25及CCR9在UC組的表達與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。UC病變范圍越廣、程度越重，CCL25及CCR9表達陽性率越高，CCL25和CCR9表達具有相關性（r=0.759，P＜0.01）。結論 CCL25/CCR9相互作用參與了UC的發生和發展。CCL25/CCR9高低反映了疾病的炎癥程度，且可能作為藥物治療的潛在靶點。

潰瘍性結腸炎 CCL25 CCR9 免疫組織化學

潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因及發病機制尚未明確且反復發作的慢性非特異腸道炎癥。目前認為其發病可能與免疫、遺傳、感染及精神等多因素有關。腸道黏膜免疫系統異常反應所導致的炎癥在潰瘍性結腸炎中起重要作用。CCL25是CC類趨化因子家族成員，CCL25與CCR9相互作用調節T淋巴細胞的遷移。本文通過免疫組織化學的方法研究CCL25/CCR9在UC中的表達情況以及與病變程度的關系，探討CCL25/ CCR9在UC發病中的作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2013年10月至2014年11月在本院門診和住院患者中因腹痛、腹瀉、便血、腹脹及里急后重等行腸鏡檢查的患者32例，經內鏡和病理證實為潰瘍性結腸炎，診斷標準參照中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組制定的IBD診斷標準［1］。其中男18例，女14例；年齡16～72歲，平均年齡42歲。均為疾病活動期。按Sutherland疾病活動指數進行病情輕重分級［1］：輕度12例，中度15例，重度5例；按Baron評分標準進行內鏡分級［2］：Ⅰ級8例，Ⅱ級15例，Ⅲ級9例；按病變累級部位分為：直腸炎6例，直乙結腸炎16例，左半結腸炎7例，全結腸炎3例。對照組20例為性別年齡相匹配的健康志愿者（7例）和結腸息肉行腸鏡檢查者，標本均經病理檢查確認為正常腸黏膜。其中男13例，女7例；年齡15～17歲，平均年齡42歲，均來自于本院內鏡室。所有觀察對象常規進行腸道準備，然后作腸鏡檢查，在病變最明顯處取組織2塊，立即置于10%的甲醛固定。健康志愿者和腸道腫瘤待行腸鏡檢查者均取正常腸黏膜2塊，立即置于10%的甲醛固定。制備組織切片，部分切片行 HE染色，光學顯微鏡下評價炎癥及潰瘍等組織學改變。另一部分用于檢測CCL25和CCR9的表達。

1.2方法 （1）免疫組化檢測步驟如下：檢測CCL25/ CCR9的免疫組化過程：標本經10%甲醛固定，包埋成蠟塊，切成4～5μm的薄片。切片經過常規脫蠟，水化，抗原修復。每張切片加1滴3%的H2O2，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；加CCL25（工作濃度15μg/ml）及CCR9（工作濃度1：300）多克隆抗體，加二抗（工作濃度1：500），室溫下孵育30min。DAB顯色、復染、脫水、透明、封片。陰性對照以PBS代替一抗。陽性結果判斷：光學顯微鏡下可見CCL25和CCR9表達陽性的細胞為棕黃色著色，背景為淡藍色。陰性對照應無棕黃色反應產物。采用以下染色積分評價標準［3］：染色強度分為4級：陰性染色（0分），弱陽性染色（1分），中度陽性染色（2分），強陽性染色（3分）；每張切片按所見陽性細胞范圍分為5級：陰性為0分，陽性細胞占1%～25%為1分，陽性細胞占26%～50%為2分，陽性細胞占51%～75%為3分，陽性細胞占76%～100%為4分。每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示。所用試劑：CCL25/CCR9多克隆抗體購自美國Santa cruz公司，均為兔源。羊抗兔IgG二抗購自美國Jackson公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術開發公司。

2　結果

2.1UC組、正常黏膜CCL25和CCR表達的比較 UC患者病變腸組織和對照組腸組織H-E染色情況見圖1。免疫組化染色情況見圖2。CCL25主要表達在腸道上皮細胞的胞質或胞膜，CCR9表達在鄰近CCL25表達區域的淋巴細胞。在正常結腸黏膜組織中，CCL25和CCR9無或僅有弱陽性表達。UC患者腸黏膜CCL25、CCR9表達水平分別為（4.38±1.64）和（4.78±1.96），均較對照組［分別為（0.66±0.52）和（0.72±0.46）］明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01）。CCL25和CCR9在UC中的表達與炎癥程度正相關。

2.2CCL25、CCR9與UC病變程度之間的關系 CCL25、CCR9表達隨UC病情加重明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

圖2　A：UC患者病變腸組織見大量CCL25的表達（×400）；B：對照組腸組織無或僅有少量CCL25的表達（×400）；C：UC患者病變腸組織見大量CCR9的表達（×400）；D：對照組腸組織無或僅有少量CCR9表達（×400）

表2　CCL25、CCR9表達與UC病變程度的關系（±s）

表2　CCL25、CCR9表達與UC病變程度的關系（±s）

注：與輕度（Ⅰ級）比較，*P＜0.01；與中度（Ⅱ級），＃P＜0.01

因素nCCL25CCR9內鏡分級 Ⅰ級82.75±0.452.83±0.39Ⅱ級15 4.56±0.90*5.31±1.40*Ⅲ級9 6.86±1.46*#7.29±1.60*#病情輕重 輕122.85±0.382.92±0.49中154.57±0.76*5.07±1.00*重5 6.75±1.39*#7.50±1.60*#對照組200.66 ± 0.520.72 ± 0.46

2.3CCL25和CCR9相關性分析 根據內鏡及病理分級，UC結腸黏膜組織中CCL25與CCR9蛋白的表達正相關（r=0.759，P＜0.01）。

3　討論

趨化因子是一類可誘導產生的具有趨化吸引性的小分子蛋白質，趨化因子通過其相應受體對多種細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、單核細胞等的趨化作用而在多種疾病的免疫反應和炎癥損傷中發揮重要作用。趨化因子可分為CXC、CC、C、CX3C四個亞族，CCL25是新近發現的CC類趨化因子家族成員，CCL25由Vicari等［4］在人和小鼠的胸腺中發現，所以又稱胸腺表達調節趨化因子（Thymus-expressed Chemokine，TECK）。Zaballos等［5］研究證明CCR9是趨化因子家族CCL25的特異性受體。實時定量PCR研究發現，CCL25 mRNA主要表達于腸道上皮細胞和胸腺樹突狀細胞，在外周血單核細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞中也有表達，但表達水平不高。CCR9 mRNA主要表達于消化道歸巢的T淋巴細胞及胃腸道和中樞神經系統的IgA分泌細胞表面［6-7］。

淋巴細胞歸巢是UC的病理特征之一，淋巴細胞歸巢離不開趨化因子的作用，UC通常是輔助性T細胞2（Th2）介導的腸道黏膜炎癥。CCL25和CCR9的相互作用主要調節淋巴細胞的歸巢，CCL25通過上調整合素受體a4b7和CCR9調節腸效應T淋巴細胞的遷移［8-9］；CCL25通過CCR9趨化T淋巴細胞進入結腸黏膜，成熟樹突狀細胞（mDC）可以激活T淋巴細胞，進而產生一系列炎癥反應［10-11］。Wurbel等［12-13］通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型研究表明，CCL25和CCR9異常表達及其相互作用參與調節結腸炎癥反應。Zhu等［14］通過惡唑酮小鼠結腸炎模型研究發現，CCL25及CCR9表達增加，CCL25與CCR9 相互作用調節并增強iNKT細胞的功能，進而參與UC的發生。Rivera-Nieves 等［15］通過自發鼠類動物模型研究發現，在慢性回腸炎早期CCR9表達增多，給予抗體阻斷CCL25/CCR9能減輕早期慢性鼠類回腸炎。本資料結果發現，CCL25在UC組中陽性表達，表達的強弱與炎癥程度成正相關，在對照組中不表達或僅有微弱的表達，差異具有統計學意義（P＜0.05）。CCR9作為CCL25的特異性受體，其表達情況與CCL25的表達情況相一致。CCL25和CCR9的表達具有相關性。CCL25與CCR9反映了疾病的炎癥程度，因而可作為病情程度監測的有效指標。

根據以上研究結果，作者認為：CCL25和CCR9參與了UC的發生和發展。CCL25通過其受體CCR9趨化淋巴細胞聚集至病變結腸，并進一步激活淋巴細胞，最終導致Th2介導的腸道黏膜炎癥。由于CCL25和CCR9在UC發病中起著重要作用，表達的強弱與炎癥程度成正相關，理論是可以將CCL25和CCR9作為治療的靶點，通過拮抗其活性將減輕炎癥損傷。由此可見，CCL25和CCR9在UC發病中起重要作用，聚集在病變結腸的淋巴細胞的激活直接導致了UC的病理變化。CCL25和CCR9反映了疾病的炎癥程度，可能成為潛在治療的靶點。

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Objective To investigate the role and the expression of chemokine CCL25and its receptor CCR9 in ulcerative colitis（UC）and to explore the relationship between CCL25 and CCR9 and the severity of disease. Methods The level of CCL25 and CCR9 in colon mucosa of UC patients was detected by immunohistochemistry method. Results The level of CCL25 and CCR9 in colon mucosa of UC patients were much higher than that of normal controls. The expressions of CCL25 and CCR9 were related to the extent of lesion and the degree of disease. The expression of CCL25 was significantly correlated with that of CCR9（r=0.759，P＜0.01）. Conclusions The expression of CCL25 is correlated with that of CCR9，CCL25 and CCR9 are closely related with the occurrence and development of UC. The expressions of CCL25 and CCR9 reflect the degree of inflammation of UC，and suggesting that CCL25 or CCR9 antagonism may represent a relevant pharmacological target for the design of novel pharmacological treatments in human UC.

Ulcerative colitis CCL25 CCR9 Immunohistochemistry

315040 浙江省寧波市第六醫院

1.3統計學方法 采用Stata13.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。CCL25和CCR9的相關性采用線性相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。