3個指標性成分用于監控芪貞降糖顆粒濃縮工藝的研究

丁麗玉，張丹，許瑩，胡佳亮，吳飛,

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，a.藥劑科，b.內分泌科，上海 200437；2.上海中醫藥大學,a.中藥學院，b.中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203)

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3個指標性成分用于監控芪貞降糖顆粒濃縮工藝的研究

丁麗玉1a，張丹1b，許瑩2a，胡佳亮2b，吳飛2a,2b

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，a.藥劑科，b.內分泌科，上海 200437；2.上海中醫藥大學,a.中藥學院，b.中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203)

目的 探索3個主要成分作為指標監控芪貞降糖顆粒濃縮工藝穩定性的可行性。方法 選擇枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷3個主要成分作為高效液相色譜法(HPLC)檢測指標，分別在常壓和減壓條件下進行芪貞降糖顆粒提取液的濃縮，測定不同溫度下不同時間點樣品中指標性成分的含量變化情況，系統考察其熱穩定性規律，用于濃縮工藝的參數確定。結果 常壓和減壓條件下經過8 h濃縮后，枸櫞酸在溫度60～80 ℃范圍內穩定性良好，90 ℃條件下轉移率下降約15%。常壓條件下經過8 h濃縮，特女貞苷在溫度60～80 ℃范圍內轉移率下降不超過13%，在90 ℃條件下轉移率下降25%；減壓條件下經過8 h濃縮，特女貞苷在溫度60～80 ℃范圍內轉移率下降不超過11%，在90 ℃條件下轉移率下降約20%。常壓和減壓條件下經過8 h濃縮后，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在60～90 ℃范圍內穩定性良好。因此，芪貞降糖顆粒的常壓和減壓濃縮溫度均應控制不超過80 ℃。3批中試放大試驗均驗證了以上規律和工藝參數的可行穩定。結論 以枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的熱穩定性作為指標得到的濃縮工藝參數，可用于芪貞降糖顆粒的制劑工藝質量控制。

芪貞降糖顆粒；濃縮；穩定性；轉移率；枸櫞酸；特女貞苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

對于中藥制劑來說，質量控制體系不僅應包括通過質量標準中的指標性成分的含量測定對制劑終端質量進行控制，還需要靠監督投料、控制生產工藝的辦法控制質量[1]。近年來中藥制劑工藝控制領域已有越來越多的研究著眼于從控制制劑過程來保證終產品的質量[2-3]，主要著眼于熱穩定性、酸堿穩定性、光穩定性、與質量關鍵屬性相關的指標性活性成分[4]。

芪貞降糖方由烏梅、靈芝、黃芪和女貞子4味中藥組成，長期的臨床應用表明其在改善患者胰島素抵抗、調節糖代謝等方面療效顯著[5-10]。在將之開發為顆粒劑的研究中，前期已經進行了正交工藝優選其提取工藝[11]。本研究以處方中的3個水溶性良好的成分為指標，考察其在常壓和減壓濃縮工藝條件下的熱穩定性規律，用于芪貞降糖顆粒的制備工藝確定和工藝穩定性的控制。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，Kromasil 100-5C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，FA2104N型電子天平(0.1 mg，上海精密科學儀器有限公司)，TE214S型電子天平(0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司)，XP205型電子天平(0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司),R206型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)，HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)，PTHW型電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司)，TGL-18C型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥 黃芪(批號:141210，產地甘肅)，制烏梅(批號:140913，產地浙江)，制女貞子(批號:141125，產地湖南)，靈芝(批號:141105，產地山東)，均購自上海康橋中藥飲片有限公司。

枸櫞酸(批號:100396-201302)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號:111920-201102)，特女貞苷對照品(批號:111926-201404)，均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法 按照已建立的高效液相色譜法(HPLC)進行樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定[11]。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，分別加甲醇制成濃度為0.529 0、0.252 0、0.050 2 g·L-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取濃縮液樣品，16 000 r·min-1下高速離心10 min，取上清液，即得。

2.2 濃縮穩定性研究 前期通過正交試驗確定了芪貞降糖顆粒的提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次提取1.5 h。按照提取工藝制備1倍處方量的提取液，供穩定性研究使用[11]。

2.2.1 常壓濃縮穩定性研究 將3次提取液合并混勻，量取800 mL提取液8份，置于燒杯中，密封，分別置于60、70、80、90 ℃恒溫水浴中保溫，每個溫度平行處理2份，定時取樣(取樣前以水補足總體積)，共考察8 h，即時間點分別為0、1、2、3、4、6和8 h。按照“2.1”項下操作，分別測定樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率，3個指標成分的常壓濃縮8 h穩定性結果分別見圖1～3。

圖1 枸櫞酸常壓濃縮工藝熱穩定性曲線

圖2 特女貞苷常壓濃縮工藝熱穩定性曲線

圖3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷常壓濃縮工藝熱穩定性曲線

由圖1可見，在溫度不高于80 ℃時，經過8 h常壓濃縮后枸櫞酸含量保持穩定，而在90 ℃條件下，轉移率下降15%。由圖2可見，特女貞苷的轉移率隨濃縮時間不斷下降：經過8 h常壓濃縮后，在60 ℃和70 ℃條件下下降均不超過5%，下降趨勢較緩，而在80 ℃和90 ℃條件下，分別下降13%和25%。由圖3可見，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在常壓濃縮溫度60～90 ℃之間保持穩定，隨濃縮時間延長，轉移率未有下降，穩定性良好。

2.2.2 減壓濃縮穩定性研究 用減壓旋轉蒸發裝置模擬提取液在生產過程中的減壓濃縮狀態[11]。將3次提取液合并混勻，量取800 mL提取液8份置于圓底燒瓶中，分別置于60、70、80、90 ℃的旋蒸減壓濃縮，每個溫度平行處理2份，定時取樣(取樣前將餾出液補回樣品溶液并混勻，以水補足總體積取樣)，共考察8 h，即時間點分別為0、1、2、3、4、6和8 h。按照“2.1”項下操作，分別測定樣品中枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率，3個指標成分的減壓濃縮8 h穩定性結果分別見圖4～6。

圖4 枸櫞酸減壓濃縮工藝熱穩定性曲線

圖5 特女貞苷減壓濃縮工藝熱穩定性曲線

圖6 毛蕊異黃酮葡萄糖苷減壓濃縮工藝熱穩定性曲線

由圖4可見，不高于80 ℃時，枸櫞酸經過8 h減壓濃縮后含量相對穩定，90 ℃條件下，轉移率下降15%。由圖5可見，特女貞苷的轉移率隨時間溫度變化：經過8 h減壓濃縮后，在60 ℃、70 ℃和80 ℃條件下下降趨勢較緩，轉移率分別下降3%、5%和11%，90 ℃條件下，轉移率下降約20%。由圖6可見，在60～90 ℃的減壓濃縮溫度范圍內，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量未隨時間下降，穩定性良好。

2.3 濃縮穩定性研究結論 經過以上穩定性研究可知，芪貞降糖顆粒的3個指標性活性成分中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的穩定性最佳，在60～90 ℃范圍內，在常壓和減壓濃縮條件下，8 h內均保持基本穩定。在常壓和減壓濃縮條件下，枸櫞酸在60～80 ℃范圍內能保持基本穩定，而90 ℃下則穩定性不佳。在常壓和減壓濃縮條件下，特女貞苷隨著溫度的升高穩定性變差，在60～80 ℃范圍內經過8 h濃縮后轉移率均下降不大，而90 ℃下則穩定性不佳，所以常壓和減壓濃縮溫度均不宜超過80 ℃。為保證以上3個指標成分尤其是熱敏性成分特女貞苷的轉移率，故在芪貞降糖顆粒濃縮過程中溫度須控制不超過80 ℃。將以上參數用于中試放大研究，以驗證此結論的可行性。3批中試產品的濃縮轉移率見表1。3批次中試生產的減壓濃縮溫度均控制在80 ℃以下，濃縮過程經歷時長約12～18 h，從表1可以發現3個指標性成分轉移率下降趨勢一致，下降率不高。歷經超過12 h的濃縮步驟后3個成分較穩定，驗證此減壓濃縮工藝可以應用于芪貞降糖顆粒的中試放大生產。

表1 中試產品濃縮工藝中3個指標成分轉移率結果/%

3 討論

中藥制劑的制備過程包括提取、分離、濃縮、干燥和成型等階段，多數需經水、醇溶劑的熱處理，各階段都可能發生一些物理、化學變化，導致制劑中有效成分的降解和損失[12]。在制劑各環節中，由于濃縮環節對工藝參數的穩定性控制要求最高，且相對耗時最長，所以此環節的質量控制最為重要[2]。

傳統思路認為，濃縮階段所選擇的指標性成分應為復方中君藥或臣藥所含的與臨床適應證、提取工藝相關的指標性成分[13]，且盡量選擇定量控制更加準確的測定方法用于監測。所以本研究初步選擇君藥烏梅、佐使藥黃芪和女貞子的指標成分作為監控指標，以HPLC法進行含量測定，而不選擇臣藥靈芝藥材所對應的多糖含量(UV法測定)作為監控指標。以此考察濃縮過程中藥液的穩定性，對芪貞降糖顆粒的濃縮工藝過程進行有效的控制。

從目前生產企業使用的設備情況來看，藥液濃縮一般都是在減壓狀態下進行。但是在一些藥品標準中，藥液的濃縮卻顯示是在常壓狀態下進行[14]。所以本研究在設計的時候就將常壓穩定性納入考察的范圍，以利于全面探索3個化合物的熱穩定性規律。

本研究分別在減壓和常壓條件下，系統全面地考察了烏梅、黃芪和女貞子3味常用中藥的指標性成分枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和特女貞苷的熱穩定性規律，指出了水提取溶液中3個成分的濃縮熱穩定性規律，不僅用于本處方的工藝控制，還可為其他采用類似工藝的處方中此類成分的研究提供重要的借鑒。但也要考慮到，化學成分的熱穩定性規律一方面取決于化合物本身的結構，另一方面也受溶液環境和其他共存成分的影響，本研究所得出的3個成分的熱穩定性規律在某種程度上與本處方組成和提取工藝密切相關。

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Application of three main components to indicate the reliability of Qizhenjiangtang Granules concentration process

DING Liyu1a,ZHANG Dan1b,XU Ying2,et al

(1a.DepartmentofPharmacy,1b.DepartmentofEndocrinology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.CollegeofChineseMaterialMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To explore the stability of Qizhenjiangtang Granules concentration process by using 3 main components as the index.Methods Citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-glucoside were chosen as the detection indicators to display the thermal stability during the concentration process.The concentrated solution were prepared under both the atmospheric and vacuum conditions.The concentration of the 3 components were determined at different time points and at different bath temperature,so as to select the suitable process parameter in this step.Results In both atmospheric and vacuum conditions,citric acid was stable between 60 ℃ and 80 ℃ and the transfer rate decreased by 15% at 90 ℃ in 8 hours.Calycosin-7-glucoside kept stable for 8 hours between 60 ℃ and 90 ℃.In the atmospheric condition,the transfer rate of specnuezhenide decreased by no more than 13% between 60 ℃ and 80 ℃ while it decreased by 25% at 90 ℃.In the vacuum condition,the transfer rate of specnuezhenide decreased by no more than 11% between 60 ℃ and 80 ℃ while it decreased by about 20% at 90 ℃.So the concentration temperature should be controlled no more than 80 ℃.The thermal stability of the 3 components and the optimal concentration parameters were validated by 3 batches of product via pilot magnification.Conclusions The parameters obtained from the stability study of citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-glucoside are suitable for the quality control of Qizhenjiangtang Granules concentration process.

Qizhenjiangtang Granules;Concentration;Stability;Transfer rate;Citric acid;Specnuezhenide;Calycosin-7-glucoside

上海市衛計委中醫醫院中藥制劑能力提升項目(ZY3-JSFC-2-2017);上海市衛計委項目資助(ZY3-CCCX-3-5001)；上海市科委平臺資助項目(15DZ2292000)

吳飛，男，副研究員，研究方向：中藥制劑分析和藥物分析，E-mail:a1983d3891h@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.009

2016-05-04，

2016-07-11)