機械攪拌發酵產細菌纖維素的中試研究

許云華,朱春林,張 衡,孫汴京,自 強,顧 焱,孫東平

(1.連云港師范高等專科學校 生命科學系,江蘇連云港 222006; 2.南京理工大學化學生物功能材料研究所,江蘇南京 210094)

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機械攪拌發酵產細菌纖維素的中試研究

許云華,朱春林,張 衡,孫汴京,自 強,顧 焱,孫東平

(1.連云港師范高等專科學校 生命科學系,江蘇連云港 222006; 2.南京理工大學化學生物功能材料研究所,江蘇南京 210094)

細菌纖維素的中試發酵實驗研究是其工業化生產的必經階段,有著極為重要的研究價值和意義。利用實驗室20 L-50 L-100 L機械攪拌發酵罐系統對細菌纖維素進行了中試實驗,測定了葡糖桿菌在20 L種子罐中的生長曲線,研究了不同培養級數的種子對100 L機械發酵罐的影響,采用轉速-溶氧(DO)聯動控制法提高發酵中后期的溶氧水平和纖維素產量。結果表明,在種子生長曲線對數期的中后期(30～48 h)移種較佳,使用三級種子移種比一級和二級種子移種的發酵周期分別短62 h和14 h,保持移種后發酵罐的菌體濃度在2.0×107CFU/mL以上對縮短發酵過程延滯期有利,轉速-DO聯動控制可保證發酵中后期DO維持在30%左右,纖維素產量由2.2 g/L提高至2.8 g/L。細菌纖維素的中試實驗結果對探索生產工藝、縮短發酵周期、降低生產成本、提高纖維素產量等方面有明顯改善,為其工業化生產奠定了基礎。

細菌纖維素,中試研究,機械攪拌,發酵周期

同植物纖維素相比,細菌纖維素(bacterial cellulose,BC)由于具有純度高[1]、親水性強[2]、超細[3]、力學強度大[4]、生物相容性好[5]等優良特性,已應用于食品[6-7]、造紙[8-9]、組織工程[10]、醫用敷料[11-12]等行業。然而,細菌纖維素的廣泛應用受制于其生產規模較小和昂貴的成本[13-14]。目前,BC的生產主要有靜態淺盤培養和生物反應器好氧深層發酵兩種方式。其中,靜態方式發酵產細菌纖維素的產量較高,但存在發酵周期長、占地面積大、產品應用范圍較小等缺點[13];動態方式發酵產細菌纖維素因供氧充足利于菌體生長,發酵周期短,生產效率高,但產量較低[13]。因此,通過小試和中試實驗研究解決制約動態發酵工業化生產的瓶頸——產量較低的問題,已經成為國內外各研究學者、相關研究機構以及企業研究的重點和難點。目前,國內有關細菌纖維素發酵方面的研究主要集中在菌種篩選與復壯[15-18]、廉價碳源和氮源的應用[19-22]、培養基組成與培養條件[23-25]、小型機械攪拌發酵罐和氣升式發酵罐[26-28]等方面,而對于100 L及以上發酵罐的系統性中試實驗研究則少見報道。同氣升式發酵罐相比,機械攪拌式發酵罐具有攪拌傳質均勻、溶氧較高、流體性質較好等優點,其缺點在于攪拌葉片的形式對DO和菌體的剪切力有較大影響,有報道[29-30]稱采用直葉攪拌葉片進行發酵時,高轉速和高剪切力的情況下菌體可能發生突變,變為不產纖維素的菌株。國內洪楓研究組[31]于近年開展了剪切力對木葡糖醋桿菌產纖維素的影響,發現采用剪切力大的六葉平漿進行發酵時產量低,而采用轉速低的框式漿進行發酵時BC產量高。同時高剪切力對菌體形態、菌體濃度都有影響,使得延滯期變長。針對DO、攪拌等對BC發酵的影響,國內外的研究者做了不少工作和研究。

由于BC的中試發酵實驗工藝對其大試生產極其重要,在大試生產前必須進行相關中試實驗研究,才能確定其生產工藝,并降低生產成本、提高產量。因此,為順利實現其工業化大規模生產,開展細菌纖維素罐體深層動態中試發酵研究具有極為重要的研究價值。本文采用實驗室已有的20 L-50 L-100 L機械攪拌式發酵罐系統,對葡糖桿菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01)產纖維素進行了種子菌體濃度、種子級數、轉速-溶氧聯動控制等BC中試發酵工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 由南京理工大學化學生物功能材料研究所篩選并經16S rDNA基因測序鑒定為葡糖醋桿菌RZS01(KomagataeibacternataicolaRZS01),現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國北京),保藏編號為CGMCC 10961;斜面保藏培養基[32]葡萄糖20 g/L,硫酸鎂0.4 g/L,檸檬酸1.5 g/L,磷酸二氫鈉2.5 g/L,蛋白胨10 g/L,瓊脂18 g/L,酵母粉0.1 g/L,pH6.0;種子培養基[32]葡萄糖20 g/L,硫酸銨6 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,硫酸鎂0.4 g/L,蛋白胨3 g/L,酵母粉2.25 g/L,羧甲基纖維素鈉0.4 g/L,自然pH;發酵培養基[32]葡萄糖22 g/L,硫酸銨5 g/L,磷酸二氫鉀4 g/L,硫酸鎂0.7 g/L,乳酸鈣0.2 g/L,檸檬酸0.6 g/L,蛋白胨5 g/L,醋酸1.0 mL/L,酵母粉3.5 g/L,羧甲基纖維素鈉0.1 g/L,pH6.0。

FZ-D型20 L、100 L機械攪拌式發酵罐和100 L氣升式發酵罐 江蘇豐澤生物工程設備有限公司;SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;QHZ-98A恒溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠;DHp-9272隔水式培養箱 上海一恒科技有限公司;XZ-21K離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;ME104E電子天平 梅特勒-托列多儀器有限公司;LWD300-38LT顯微鏡 上海測維光電技術有限公司;CELL-VUCBC DRM-700細胞計數板 南京裕安儀器有限公司;Inpro3030 pH電極 METTLER TOLED0;Inpro6800溶氧電極 METTLER TOLED0;HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華化器制造有限公司;PH5-3C pH計 雷磁儀電科學儀器廠;BCD-201KCK冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中試發酵產細菌纖維素的基本工藝流程 本實驗中,葡糖醋桿菌產細菌纖維素的基本工藝流程如下[32]:

斜面菌種→一級搖瓶種子培養((30±1) ℃,160 r/min)→二級搖瓶種子擴培→20 L種子罐(三級)培養((30±1) ℃)→100 L發酵罐發酵培養((30±1) ℃)→動態細菌纖維素后處理→保存或進行實驗研究。

上述發酵工藝流程中,可分別依據實驗工藝選擇一級、二級或三級種子進行移種和后續動態深層發酵實驗。

1.2.2 20 L種子罐中種子擴培與工藝實驗 按種子培養基組成配制10 L種子液(先定容至8.5 L,實消時會產生約1.5 L的蒸汽冷凝水),調pH至6.0,按0.5‰的比例加消泡劑(江蘇賽歐),種子液加至20 L種子罐中進行實消(121 ℃,20 min)。冷卻至30 ℃后,火焰保護下,以8%比例接種搖床中培養好的種子。培養過程中每隔6 h測定的參數主要有:還原糖濃度、pH、DO和木醋桿菌細胞濃度(菌體濃度)。

采用20 L機械攪拌種子罐在種子培養時的實驗工藝參數主要有:液氣比為1∶0.25(通氣量為0.16 m3/h),轉速為300 r/min,培養溫度為30 ℃,罐壓為0.08 MPa。在此條件下,進行了葡糖桿菌的種子培養。

分別采用20 L種子罐生長過程中細胞生長曲線對數期的前期(18 h)、中期(30 h)和后期(48 h)的種子,以10%比例接種至100 mL發酵液中(500 mL三角瓶)進行搖瓶發酵實驗。4天后,經過過濾除菌、漂白漂洗等后處理工藝,于普通烘箱中80 ℃烘干12 h,測得搖瓶中細菌纖維素的干態產量。

1.2.3 一級、二級、三級種子發酵與工藝實驗 由于工業化大生產時,采用的發酵罐容積一般在10～300噸左右,按照BC實驗過程中的接種量和菌體濃度計算,需要的種子液量較大,一般都超過1噸。為保證BC發酵時移種的種子在發酵罐發酵BC過程中,有合適菌體濃度的種子和種子液量,應制備二級或三級種子。二級或三級種子對機械攪拌發酵罐發酵BC過程的影響將直接關系到大生產時的各項工藝、參數的確定和最終BC產量。因而,實驗中研究了一級、二級和三級種子對100 L機械攪拌發酵罐的發酵過程、發酵工藝、成本控制和BC產量的影響。實驗中使用的攪拌發酵罐的葉片形式為下層斜葉、上層直葉,在保證發酵過程中較高DO的同時,減輕了剪切力對菌體的不利影響。

為模擬大試生產工藝,分別進行一級、二級和三級種子發酵中試實驗。一級種子發酵時,直接以恒溫振蕩培養箱中培養好的搖瓶種子對100 L機械罐進行接種,接種量為1%(700 mL種子/70 L發酵液);二級種子發酵時,一級種子為恒溫振蕩培養箱中培養的搖瓶種子,二級種子在20 L種子罐中培養,接種比例分別為1%和8%;三級種子發酵時,一級種子在恒溫振蕩培養箱中培養,二級種子在恒溫振蕩培養箱中擴培,三級種子在20 L種子罐中培養,接種比例分別為1%、8%和8%。

為保證各批次發酵罐發酵BC過程參數、工藝的一致性,設定了100 L機械攪拌發酵罐的發酵條件:轉速為200 r/min、培養溫度為30 ℃、罐壓為0.08 MPa、通氣量 2.3 m3/h。同時,結合大生產時可能出現的低接種量的問題,對于待移種至發酵罐中的種子質量進行控制。主要工藝參數包括:一級、二級和三級種子發酵的移種比例分別為1%、8%和8%,各級培養種子的周期分別為40、24、24 h左右。

100 L機械攪拌發酵罐的裝液量為70 L,pH、DO、溫度為在線監測控制。其它主要測定的參數有:菌體濃度、還原糖、BC產量等。

1.2.4 100 L發酵罐轉速與溶氧聯動對發酵產BC的影響實驗 在以100 L機械攪拌發酵罐進行中試實驗過程中,DO隨發酵時間、菌體濃度、纖維素產量的上升而下降。為了研究溶解氧相對含量對發酵各參數和BC產量的影響,進行DO與轉速的聯動中試實驗。當BC發酵過程中的DO低于30%時,提高轉速以提高溶解氧相對含量,檢測各工藝參數和BC產量的變化情況。

1.3 實驗參數檢測方法

還原糖測定:采用工業測糖法進行測定[32]。

pH、DO測定[32]:均采用在線實時檢測,其中DO校準時,以大氣中含氧量標定為100%,以實消過程中121 ℃、0.1 MPa條件下標定為0。

菌體濃度測定[32]:采用進口血球計數板進行細胞計數,計數前按需要將發酵液稀釋一定的倍數。

BC產率測定[32]:依據實驗需要按8 h或6 h或一定的發酵周期進行取樣,在發酵罐取樣口遵循無菌取樣操作每次取100 mL發酵液。過濾除去培養液,收集絮狀BC并分散在含3‰ NaOH和3‰ H2O2的水溶液中,于80 ℃水浴鍋中處理2～4 h。用自來水沖洗至中性后,將BC放置于80 ℃的普通干燥箱中干燥12 h,計算每升培養液中所含有的BC干重即為BC產率。

2 結果與分析

2.1 20 L種子罐相關工藝、參數研究

為研究機械攪拌式種子罐在葡糖桿菌的培養過程各工藝參數的變化,詳細測定或監測了種子培養過程中還原糖、pH、DO和葡糖桿菌細胞濃度(菌體濃度)的變化情況。如圖1中所示,可以發現在20 L種子罐的種子液培養過程中,前12 h中葡糖桿菌細胞濃度(菌體濃度)變化不大,大約在2×107CFU/mL左右,表現為典型的細胞生長曲線的延滯期;在12～48 h期間,菌體濃度迅速增加到22×107CFU/mL,為葡糖桿菌的對數生長期,在該階段中種子液的還原糖、pH和溶氧均大幅下降;48 h后菌數增加緩慢,過渡至葡糖桿菌細胞的平穩生長期。

圖1 20 L種子罐培養過程中菌體濃度等工藝參數的變化情況Fig.1 Process parameters curves such as cell concentration during the seed culture process in 20 L fermentor

為研究不同時期的菌體濃度對后續BC發酵的影響,依據1.2.2節中的實驗方法,測定出在種子罐生長的第18、30、48 h接種到搖瓶中于恒溫振蕩培養箱中培養的BC發酵產量分別為4.7、6.8、7.0 g/L。實驗表明,在20 L種子罐中,實驗室的葡糖桿菌于細胞生長曲線的中后期移種對后續動態發酵BC的產量提高有利,較為合適,移種時的葡糖桿菌菌體濃度約為19×107CFU/mL。

從上述實驗結果中,發現葡糖桿菌種子質量的好壞對BC發酵的產量和發酵周期有著重要影響。選擇恰當的移種時機和種子菌體濃度對提高BC的發酵產量是很關鍵的。選擇種子生長曲線中的對數期前期移種,則菌體濃度較低,發酵罐中延滯期太長;選擇種子生長曲線對數期后期移種,菌體濃度雖高,但影響總發酵周期;因而,選擇種子生長曲線對數期的中后期是比較合適的工藝,可同時保證較高的菌體濃度和較短的總發酵周期。

2.2 分級發酵對BC發酵中試工藝的影響

采用一級種子移種并在100 L機械攪拌發酵罐中(發酵液量為70 L)進行BC的發酵中試實驗,發酵過程中的還原糖、pH、DO、菌體濃度和BC產量隨培養周期的變化如圖2所示。

從圖2中可以明顯發現,在發酵周期前24 h,還原糖、pH、DO菌體濃度和BC產量等均未發生明顯變化,表明以一級種子移種進行100 L機械攪拌罐的動態發酵時存在類似于種子罐種子生長過程的延滯期。在發酵周期第24～48 h期間,還原糖、pH和DO均有小幅消耗或下降,菌體濃度和BC產量開始較明顯增加,但增長的速率較小。在發酵周期第48～94 h期間,各參數均出現大幅變化。具體表現為:還原糖濃度由2.4 g/L大幅下降至1.3 g/L;pH先下降至5.0,在小幅反彈上升至5.2后繼續大幅降低;DO則迅速下降至20%左右,表明發酵罐中的葡糖桿菌細胞在大量消耗氧氣;而菌體濃度則明顯處于對數生長期,菌體濃度由1.0×107CFU/mL增加至8.8×107CFU/mL;在纖維素產量方面,則由0.2 g/L快速提高至1.8 g/L。在發酵周期94～120 h期間,pH繼續下降、還原糖和DO分別下降至1.0 g/L和17%后趨于穩定,而菌體濃度和BC產量均小幅提高。在發酵罐發酵后期,以BC產量、還原糖、pH等工藝參數不再明顯變化時為發酵終點。本批次發酵終點在第120 h,最終BC產量為2.08 g/L。

圖2 以一級種子移種進行BC的100 L機械攪拌罐動態發酵實驗Fig.2 BC fermentation experimental curves usinggrade one seed in 100 L stirred tank fermentation

以二級種子移種進行的100 L機械攪拌罐的動態發酵過程中各參數的變化情況見圖3所示。在BC動態發酵周期前24 h中,各還原糖、菌體濃度等各工藝參數均無明顯降低或增加,表明葡糖桿菌細胞生長過程仍處于延滯期。而在24～60 h發酵周期中,還原糖、pH和DO迅速下降,菌體濃度和BC產量同步增加或提高,其中發酵第60 h時的菌體濃度達到10.5×107個mL,BC產量接近2.0 g/L。在BC動態發酵周期的第60～72 h期間,菌體濃度、還原糖等工藝參數趨于穩定,DO和pH小幅下降。發酵終點時還原糖為0.8 g/L,BC產量為2.18 g/L。同一級種子移種的100 L發酵罐發酵實驗相比,發酵周期由120 h大幅縮短至72 h,而BC產量還略有增加,降低了能耗等生產成本,提高了生產效率。

圖3 以二級種子移種進行BC的100 L機械攪拌發酵罐動態發酵實驗Fig.3 BC fermentation experimental curves using grade two seed in 100 L stirred tank fermentation

以培養好的三級種子進行移種,在100 L機械攪拌發酵罐中進行BC的動態發酵,過程中的工藝參數變化見圖4。從圖4中可發現從三級種子液移種到100 L機械攪拌發酵罐之后,發酵液的pH、DO、還原糖即迅速下降,而菌體濃度和BC產量則開始提高,未出現圖2和圖3中明顯存在的延滯期。分析其原因,發現待移種的三級種子菌體濃度較高,移種后發酵罐中的葡糖桿菌菌體濃度達到2.2×107CFU/mL,表明適當提高移種種子液的菌體濃度對縮短后續發酵罐中的延滯期有明顯作用。發酵周期的前48 h,葡糖桿菌基本處于對數生長期,發酵液中的菌體濃度最高達到13.8×107CFU/mL。而BC產量的提高基本與菌體濃度的提高同步進行,與一級種子和二級種子發酵過程類似,表明葡糖桿菌細胞代謝分泌BC與細胞生長關聯性大,屬于生長相關型。在發酵過程的48～58 h期間,還原糖、pH、菌體濃度等各參數變化趨于平緩。BC的終產量為2.21 g/L,比一級、二級種子發酵產量略高。但發酵罐的發酵周期僅為58 h,明顯少于一級發酵的120 h和二級發酵的72 h,在大生產中放大后將節省大量成本、產生明顯的經濟效益。

圖4 以三級種子移種進行BC的100 L機械攪拌發酵罐動態發酵實驗Fig.4 BC fermentation experimental curves using grade three seed in 100 L stirred tank fermentation

表1 不同級數種子移種發酵中試實驗工藝參數比較

通過采用不同級數的種子液進行100 L機械攪拌發酵罐的中試實驗,發現培養的不同級數種子對發酵周期、前期細胞生長延滯期等工藝有明顯影響。表1列出了采用不同級數種子移種進行中試實驗的主要工藝參數的比較。在總發酵周期方面,采用一級、二級和三級種子移種后發酵的總周期分別為160、138、146 h。結果表明采用二級和三級種子進行BC的動態發酵(100 L機械罐)總周期明顯短于采用一級種子進行發酵,而采用三級種子進行動態發酵的總周期略長于二級種子,但在100 L發酵罐中進行發酵的周期比二級種子短14 h。

不同種子級數發酵的本質在于移種時種子菌體濃度和生長狀態的不同,而大多數研究者對發酵罐的多級發酵與BC產量和相關工藝參數的關系沒有做系統性研究。本文研究認為,應當依據生產時發酵罐的大小和制種條件、能力選擇合適的種子培養級數。關鍵在于保證移種時種子處于對數生長期的中后期、移種后發酵罐中的菌體濃度不低于2.0×107CFU/mL,以此確保發酵罐中菌體濃度的增長和BC發酵可快速進入對數期。

2.3 溶解氧與轉速聯動提高BC產量的中試研究

在前述BC的動態發酵中試實驗中,觀察到DO隨發酵周期的延長而呈現逐步下降的趨勢,主要是由于其中葡糖桿菌的大量增殖和發酵液粘度的增加導致的。在機械攪拌發酵時,DO對BC發酵產量有重要影響。本實驗中采用轉速-DO聯動的方法,對100 L機械攪拌發酵罐的DO進行控制。當DO低于30%時,提高攪拌轉速,100 L機械罐發酵過程中測得的轉速對DO的影響曲線見圖5所示。從圖5中發現,在發酵周期的第40 h時,DO下降至25%左右,提高攪拌轉速(從200 r/min提高至250 r/min)后,DO提高至53%。之后,DO仍快速下降,表明葡糖桿菌細胞在大量耗氧。在發酵周期第52 h和56 h時DO低于30%,分別提高攪拌轉速,DO值再次提高至30%以上。

圖5 100 L機械罐中轉速對溶解氧的影響Fig.5 Effect of rotating speed on dissolved oxygen in 100 L stirred tank fermentation

在上述轉速-DO聯動控制條件下,100 L機械罐中BC發酵過程參數曲線見圖6。BC動態發酵過程中還原糖和pH分別下降至0.6 g/L和4.05,菌體濃度則達到較高的20.2×107CFU/mL,BC終產量高達2.8 g/L。同未進行轉速-DO聯動控制的100 L機械罐BC發酵實驗相比,本批次實驗中葡糖桿菌菌體濃度和BC終產量均得到大幅提高,結果表明轉速-DO聯動控制對提高中試發酵中后期的DO、菌體濃度和BC產量是一種有效的方法。

圖6 溶解氧與轉速聯動控制100 L機械罐BC發酵過程參數曲線變化Fig.6 BC fermentation process parameters curves with the control of dissolved oxygen and rotational speed in 100 L stirred tank

實驗結果表明,發酵過程中保持一定濃度的DO對BC機械攪拌罐動態發酵產量的提高有利。

3 結論

采用100 L機械攪拌發酵罐研究了細菌纖維素的中試發酵工藝。結果表明當移種前種子菌體濃度為19×107CFU/mL時適于100 L機械攪拌發酵罐BC的動態發酵。采用三級種子進行BC動態發酵有利于縮短發酵罐的發酵周期,可分別比采用一級和二級種子進行培養的動態周期短62 h和14 h。轉速-DO聯動控制,保持發酵過程中發酵液的DO在30%以上時可將BC中試發酵產率從2.2 g/L提高到2.8 g/L。本研究組進行了BC的中試發酵,在種子菌體濃度、種子級數和轉速-DO聯動方面開展了相關中試研究,取得了初步成果。下一步,還將繼續深入開展廉價碳源[33]、補料發酵、發酵中后期流體狀態、氣升式反應器等方面的BC中試發酵研究,并對發酵罐中的菌體生長、產物生成和基質消耗等實驗數據進行擬合,建立木醋桿菌生長代謝趨勢的動力學模型[34-35],以深入探討木醋桿菌發酵產細菌纖維素機理及發酵罐中發酵條件的優化。

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Mechanical stirring fermentation pilot study of bacterial cellulose

XU Yun-hua1,ZHU Chun-lin2,ZHANG Heng2,SUN Bian-jing2,ZI Qiang2,GU Yan2,SUN Dong-ping2,*

(1. Department of Life Sciences,Lianyungang Normal College,Lianyungang 222006,China;2. Chemicobiology and Functional Materials Institute of Nanjing University of Science and Technology,Nanjing 210094,China)

The pilot fermentation experiment of bacterial cellulose(BC)is a necessary stage for its industrial production. It has a very important value and significance. The pilot fermentation experiment were systematically researched using 20 L-50 L-100 L laboratory stirred tank fermentation system. The growth curve ofKomagataeibacternataicolaseeds at 20 L fermentor were determined. The effects of different seed culture series on 100 L mechanical fermentation tank were studied. To improve the level of dissolved oxygen,stirring speed-dissolved oxygen(DO)linkage control method were used during fermentation and cellulose production. The results showed that suitable inoculation period was in the middle and late stage of logarithmic phase(30～48 h). The fermentation period using grade three seed was 62 h and 14 h shorter than grade one and two,respectively. To shorten the fermentation process delay time,the bacteria concentration in the fermentation tank was more than 2.0×107CFU/mL after inoculation with bacteria. Stirring speed-DO linkage control could ensure DO maintained at around 30% and increased BC yield to 2.8 g/L. This research is beneficial with shortening the fermentation cycle,reducing the production cost,improving the yield of cellulose,and laying foundations for the industrial production. The pilot experiment study results of BC have a significant improvement in the production process.

Bacterial cellulose;pilot study;mechanical agitation;fermentation period

2016-03-30

許云華(1968-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物學、生理學，E-mail：xyh6322@126.com。

*通訊作者: 孫東平(1970-)，男，博士，教授，研究方向：生物功能材料、微生物工程等，E-mail：dongpingsun@163.com。

國家自然科學基金(21206076)；江蘇省高等職業院校國內高級訪問學者計劃資助項目(2015FX032)；江蘇省高校自然科學研究面上項目資助(16KJB180034)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000