豌豆白粉菌侵染對(duì)活性氧迸發(fā)規(guī)律和紫花苜蓿葉片結(jié)構(gòu)的影響

張?jiān)伱?馬暉玲,唐云智

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測(cè)試中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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豌豆白粉菌侵染對(duì)活性氧迸發(fā)規(guī)律和紫花苜蓿葉片結(jié)構(gòu)的影響

張?jiān)伱?,2,馬暉玲2,唐云智2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測(cè)試中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

以專性寄生菌豌豆白粉菌接種紫花苜蓿，采用比色法和組織化學(xué)法對(duì)活性氧·O2-和H2O2迸發(fā)的時(shí)間、強(qiáng)度及作用位點(diǎn)進(jìn)行了研究；并就侵染部位的葉片制作了石蠟切片，對(duì)葉片結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，接種后，抗性品種慶陽(yáng)苜蓿·O2-和H2O2迸發(fā)均呈雙峰形，·O2-出現(xiàn)在接菌后4和48 h，H2O2出現(xiàn)在接菌后4和24 h，且第一次高峰強(qiáng)度高于第二次；而感病品種德寶苜蓿·O2-含量未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，H2O2迸發(fā)呈單峰形，僅在接菌后4 h出現(xiàn)一次迸發(fā)高峰。對(duì)活性氧ROS的作用位點(diǎn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在葉片表面和內(nèi)部細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的·O2-沉積位點(diǎn)；而H2O2產(chǎn)生并積累于苜蓿上、下表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜及受侵染處葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。此外，首次發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后，苜蓿葉片組織結(jié)構(gòu)也相應(yīng)發(fā)生了改變，表皮細(xì)胞下的柵欄組織由一個(gè)長(zhǎng)柱形細(xì)胞變?yōu)榱硕鄠€(gè)卵圓形細(xì)胞，以致難以區(qū)分柵欄組織和海綿組織。本研究結(jié)果說(shuō)明，不同植物種與病原菌互作中，活性氧積累的時(shí)間和強(qiáng)度均不相同，啟動(dòng)防御反應(yīng)的活性氧種類亦不同；苜蓿葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變可能是抵御白粉菌侵染的積極反應(yīng)之一。

過(guò)氧化氫；超氧陰離子；過(guò)敏性反應(yīng)；解剖結(jié)構(gòu)

苜蓿(Medicagospp.)是一種產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、耐刈割的優(yōu)良豆科牧草，對(duì)于我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和畜牧業(yè)發(fā)展具有重要作用。其根系發(fā)達(dá)，具有根瘤菌更是改良土壤和水土保持的重要植物[1-2]。目前，世界上苜蓿種植面積約0.33億hm2，其中，我國(guó)現(xiàn)有栽培面積約188萬(wàn)hm2。由于苜蓿的大面積種植，粗放型經(jīng)營(yíng)，為病害的猖獗創(chuàng)造了條件。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)的苜蓿病害大約有數(shù)十種[3-4]，嚴(yán)重影響苜蓿的產(chǎn)量和飼用品質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)成分降低，有害物質(zhì)增加)，進(jìn)而影響家畜健康，降低畜產(chǎn)品質(zhì)量[5]。據(jù)報(bào)道苜蓿霜霉病、褐斑病等多種病害造成苜蓿減產(chǎn)大約在15%～70%[3]，粗蛋白含量和可消化率均顯著下降[6-11]。近幾年來(lái)，隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，苜蓿種植面積進(jìn)一步擴(kuò)大，病害問(wèn)題嚴(yán)重影響我國(guó)畜牧業(yè)和草產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)足發(fā)展。

近幾年來(lái)，人們致力于研究植物的抗病性及其調(diào)控機(jī)制。越來(lái)越多的證據(jù)表明以超氧陰離子(·O2-)和過(guò)氧化氫(H2O2)為主要成分的活性氧(reactive oxygen species, ROS)在植物抗病反應(yīng)中起重要作用。植物與病原菌相互識(shí)別能誘導(dǎo)ROS在短時(shí)間內(nèi)快速產(chǎn)生并大量累積，產(chǎn)生活性氧迸發(fā)[12-13]。研究表明，活性氧迸發(fā)能啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化作用，促進(jìn)寄主產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)[14]；H2O2和·O2-等活性氧對(duì)病原菌具有直接的毒害作用。Keppler等[15]以野火病細(xì)菌接種煙草(Nicotianatabacum)懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞液產(chǎn)生大量活性氧，細(xì)菌數(shù)量顯著下降，加入SOD酶后細(xì)菌數(shù)量又增加，并推遲了HR的出現(xiàn)時(shí)間；活性氧可以使植物細(xì)胞壁的強(qiáng)度增強(qiáng)，引發(fā)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白和酚類物質(zhì)的交聯(lián)，還能將多聚糖連接成聚合體，加固細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[16]；活性氧能誘導(dǎo)植保素的生成。已有大量報(bào)導(dǎo)證明植保素的合成需要活性氧，活性氧直接或間接地調(diào)節(jié)著與植保素合成相關(guān)基因的表達(dá)[17]。此外，活性氧參與系統(tǒng)獲得抗性(system acquired resistance, SAR)的建立。水楊酸作為誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性不可缺少的重要信號(hào)分子，其作用可能是通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶的活性而引起H2O2水平的上升，由H2O2或其他活性氧作為第二信使，激活抗病途徑中的防御相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的[18]。活性氧在植物體內(nèi)具有多條產(chǎn)生途徑，其產(chǎn)生部位主要是存在多種氧化酶的細(xì)胞壁[19-20]、光合電子傳遞鏈的葉綠體[21]以及呼吸作用的線粒體和微粒體[21-22]；相應(yīng)地，植物體內(nèi)也擁有多種抗氧化酶和豐富的抗氧化物質(zhì)兩大酶促的和非酶促的自由基清除系統(tǒng)。

有關(guān)活性氧在植物中的產(chǎn)生機(jī)制、清除系統(tǒng)、生理功能等方面已進(jìn)行了大量的研究。在植物與病原物互作體系中，尤其對(duì)單子葉植物小麥(Triticumspp.)與條銹病互作下活性氧的迸發(fā)規(guī)律、空間分布位點(diǎn)，以及相應(yīng)的氧清除系統(tǒng)進(jìn)行了較深入的研究[23-25]。然而，雙子葉植物苜蓿與專型寄生菌豌豆白粉菌互作中的活性氧迸發(fā)特征，尤其是白粉菌侵染后苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)變化的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

植物在與病原菌協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，演化出的抗病方式千差萬(wàn)別、各有千秋。目前，飼草作物的抗性機(jī)制研究遠(yuǎn)落后于糧食作物和蔬菜作物。本研究擬以豌豆白粉菌(Erysiphepisi)接種抗/感性不同的苜蓿品種(德寶——高感品種S，慶陽(yáng)苜蓿——高抗品種R)，通過(guò)對(duì)H2O2、·O2-的測(cè)定和組織化學(xué)定位，研究活性氧迸發(fā)對(duì)病原菌侵染的時(shí)間和空間的響應(yīng)；白粉菌侵染后，苜蓿的防御系統(tǒng)在解剖學(xué)方面的積極應(yīng)對(duì)。掌握活性氧積累和苜蓿抗病性之間的關(guān)系，為充分利用苜蓿的自身抗病性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的種植與取樣方法

紫花苜蓿材料“德寶”(Medicagosativavar. derby)和“慶陽(yáng)苜蓿” (Medicagosativavar. qingyang)種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)曹致中教授饋贈(zèng)。

選取籽粒飽滿的苜蓿種子于2014年7月1日播種于直徑30 cm的花盆中，澆透水，并覆以PE薄膜(0.01 mm)保濕。出苗后，于黃昏時(shí)去掉薄膜。待幼苗長(zhǎng)至3 cm高時(shí)，進(jìn)行疏苗，每盆保留15株左右健壯幼苗。苜蓿豌豆白粉菌采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站，經(jīng)鑒別確定無(wú)誤后在甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿上隔離繁殖。2014年8月25日收集新鮮菌絲體和分生孢子采用涂抹法進(jìn)行接種。接種后搭小拱棚并覆以PE膜保濕。

分別于接種后0、3、7、13 d取樣，取苜蓿小葉置5 mL離心管中加入卡諾液固定，觀察菌絲生長(zhǎng)情況；取苜蓿小葉分別加入3-(N-嗎啉)丙磺酸液(MPOS液)(含二氨基聯(lián)苯胺DAB)(對(duì)照葉片先置于牛肝過(guò)氧化氫酶液中2 h，再置于 MPOS液)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸液(HEPES液)(含氮藍(lán)四唑NBT)(對(duì)照葉片先置于超氧化物歧化酶中30 min，再置于HEPES液)中觀察H2O2和·O2-沉積位點(diǎn)；分別于接種后0.5、1、2、4、8、24、48、72和96 h取樣，稱取0.5 g樣品多份用錫鉑紙包好，迅速投入到液氮中，于-80 ℃貯存?zhèn)溆脺y(cè)·O2-和H2O2含量。

1.2·O2-含量的測(cè)定

參照王晨芳[24]文獻(xiàn)，采用羥胺氧化法。0.5 g葉片加2.5 mL磷酸緩沖液(pH 7.8，0.1 mol/L)研磨勻漿，10000 r/min離心10 min 。取上清液1 mL加0. 9 mL上述磷酸緩沖液，再加0. 1 mL 10 mmol/L鹽酸羥胺，25 ℃溫育培養(yǎng)20 min。然后加入1 mL 17 mmol/L的對(duì)氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L的α-萘胺，25 ℃下再溫育培養(yǎng)20 min。反應(yīng)后的顯色液用同體積乙醚充分搖勻，6000 r/min離心分層，棄去乙醚相，取粉紅色的水相測(cè)A530，用磷酸緩沖液代替樣品做空白。用NaNO2做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線y=234.4x-3.3316 (R2=0.9939)上求出·O2-值，單位為μmol/L。

1.3 H2O2含量的測(cè)定

參照Patterson等[26]的方法并改進(jìn)。0. 5 g葉片加少許石英砂和3 mL預(yù)冷的丙酮磨成勻漿，10000 r/min離心10 min ，保留上清液。取0.5 mL上清液加0.1 mL含20% (V/V) TiCl4的濃鹽酸溶液和0. 2 mL濃氨水(17 mol/L)，混合后6000 r/min離心10 min，生成的過(guò)氧化物Ti復(fù)合物用丙酮洗5次，丙酮揮發(fā)后溶于4 mL 2 mol/L的硫酸中測(cè)A410。另外以 H2O2做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.6583x-0.0305 (R2=0.9942)上求出H2O2值，單位為μmol/L。

1.4·O2-細(xì)胞化學(xué)定位

苜蓿小葉剪下后立即浸入0.1% 的 NBT(溶劑為50 mmol/L pH 7.2的HEPES緩沖液)(含10 mmol/L 疊氮鈉)中，真空抽濾5～10 min，光照至出現(xiàn)特異性的藍(lán)色斑點(diǎn)，葉片浸入熱酒精中脫色。陰性對(duì)照葉片用NBT染色之前，先浸入1 mmol/L SOD酶中3 h，然后再浸入NBT 中染色。Motic SMZ-168體視顯微鏡觀察并拍照。觀察后的葉片制作為石蠟切片，厚度5 μm。切片無(wú)需染色，二甲苯透明后直接封片。ZEISS Imager A2顯微鏡觀察，采用 Axio Cam MRc5 軟件進(jìn)行圖像采集。

1.5 H2O2細(xì)胞化學(xué)定位

紫花苜蓿小葉剪下后立即浸入1% DAB (溶劑為50 mmol/L pH 7.2的MOPS緩沖液)中，真空抽濾5 min后，室溫下避光溫育8 h。至DAB與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生棕色斑點(diǎn)以后，將葉片浸入熱酒精中使葉片脫色并使棕色斑點(diǎn)顯現(xiàn)。為了核實(shí)染色沉積物的特異性，將對(duì)照葉片用DAB染色之前，先浸入25 μg/μL牛肝過(guò)氧化氫酶中2 h，然后再浸入1% DAB 中染色30 min。Motic SMZ-168體視顯微鏡觀察并拍照。觀察后的葉片制作石蠟切片，厚度5 μm。切片無(wú)需染色，二甲苯透明后直接封片。ZEISS Imager A2顯微鏡觀察，采用 Axio Cam MRc5 軟件進(jìn)行圖像采集。

1.6 木質(zhì)素化學(xué)定位

苜蓿葉片先用一滴1 mol/L鹽酸浸透，然后滴加一滴含5%～10%間苯三酚的85%酒精溶液，木質(zhì)化的部位即被染為桃紅色至紫紅色。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)ANOVA分析所測(cè)數(shù)據(jù)，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性氧迸發(fā)

圖1 接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片·O2- 迸發(fā)趨勢(shì)Fig.1 After inoculation with E. pisi, the tendency of ·O2- burst in M. sativa不同小寫(xiě)字母代表慶陽(yáng)苜蓿間P<0.05顯著水平；不同大寫(xiě)字母代表德寶苜蓿間P<0.05顯著水平。下同。Different lowercase letters denote significant differences at P<0.05 in Qingyang alfalfa; Different capital letters denote significant differences at P<0.05 in Derby alfalfa. The same below.

圖2 接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片H2O2迸發(fā)趨勢(shì)Fig.2 After inoculation with E. pisi, the tendency of H2O2 burst in M. sativa

2.1.1 苜蓿葉片中·O2-迸發(fā)時(shí)間及強(qiáng)度 紫花苜蓿接種豌豆白粉菌之后，抗病性不同的苜蓿品種其·O2-迸發(fā)表現(xiàn)不盡相同。慶陽(yáng)苜蓿葉片·O2-迸發(fā)呈雙峰形，迸發(fā)高峰分別出現(xiàn)在接種后4和48 h，強(qiáng)度分別是接種前的2.55和1.71倍。德寶苜蓿·O2-濃度未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，始終在0.1076 μmol/L左右。

2.1.2 苜蓿葉片中H2O2迸發(fā)時(shí)間及強(qiáng)度 接種豌豆白粉菌之后，抗病性不同的苜蓿品種葉片中產(chǎn)生H2O2的時(shí)間點(diǎn)和積累量不完全一致。慶陽(yáng)苜蓿H2O2迸發(fā)呈雙峰形，迸發(fā)高峰分別出現(xiàn)在接種后4和24 h，強(qiáng)度分別是接種前的3.27和1.61倍。德寶苜蓿H2O2迸發(fā)呈單峰形，迸發(fā)高峰出現(xiàn)在接種后4 h，且強(qiáng)度是接種前的2.99倍。

2.2 活性氧的定位

2.2.1 苜蓿葉片中·O2-組織化學(xué)定位 分別于接種后0、3、7、13 d取樣，以NBT染色苜蓿葉片，對(duì)·O2-進(jìn)行組織化學(xué)定位，觀察·O2-在葉片的集聚位點(diǎn)。預(yù)以SOD酶清除·O2-，再以NBT染色的葉片作為對(duì)照(圖3A)。由圖3可以觀察到：白粉菌接種苜蓿葉片后，0～13 d的葉片上未見(jiàn)到明顯的藍(lán)色著色點(diǎn)，即·O2-集聚位點(diǎn)(圖3A～E)；在接種7 d的葉片上出現(xiàn)大量枯黃色的HR壞死斑點(diǎn)(圖3D)；13 d的葉片上肉眼可見(jiàn)白粉菌菌絲體(圖3E，箭頭所指)覆蓋在葉片表面。將觀察并拍照后的苜蓿葉片制作成石蠟切片，對(duì)其組織進(jìn)行更細(xì)致的觀察。在目鏡10倍，物鏡分別為10和40倍的鏡頭下，葉片橫切面上、下表皮細(xì)胞、海綿組織和柵欄組織細(xì)胞清晰可辨，可是仍未發(fā)現(xiàn)明顯的·O2-的藍(lán)色(圖3G～J)著色位點(diǎn)。圖3F相片所示葉片上的藍(lán)色著色斑點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)是田間白虱取食傷口為NBT染色所致。

圖3 接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片·O2- 集聚位點(diǎn)Fig.3 After inoculation with E. pisi, the location of ·O2- accumulation in M. sativa A～E：白粉菌侵染的苜蓿葉片；F:白虱取食的苜蓿葉片；G～J：苜蓿葉片橫切面(×10和×40倍，藍(lán)色部位為·O2- 組織化學(xué)定位處)。SOD+NBT：NBT染色前先以SOD預(yù)浸泡的對(duì)照；NBT：以NBT直接染色的樣品。vb: 維管束； pt: 柵欄組織； st: 海綿組織； de: 下表皮； ue: 上表皮。 A-E: Represent alfalfa leaves infected by E. pisi; F: Alfalfa leaves ingested by louselice; G-J: Section of leaf (×10 and ×40 times, blue spots were location of ·O2-). SOD+NBT: The controls soaked in SOD before dyeing with NBT; NBT: The samples dyed with NBT. vb: Vascular bundle; pt: Palisade mesophyll cell; st: Spongy mesophyll cell; de: Down-epidermis; ue: Upper-epidermis.

圖4 接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片H2O2集聚位點(diǎn)Fig.4 After inoculation with E. pisi, the location of H2O2 accumulation in M. sativa K1～K3，L1～L3:苜蓿葉片；K4～K5，L4～L5，M，N：苜蓿葉片橫切面(×10和×40倍，棕色部位為H2O2組織化學(xué)定位處)。K1～K5：CAT預(yù)處理的對(duì)照苜蓿葉片；L1～L5：MOPS緩沖液含DAB染色的苜蓿葉片；CAT+DAB：DAB染色前先以CAT預(yù)浸泡的對(duì)照；DAB：以DAB直接染色的樣品。M：DAB染色的健康苜蓿葉片；N：DAB染色的感病苜蓿葉片。K1-K3, L1-L3:Alfalfa leaves; K4-K5, L4-L5, M, N: Section of leaf (×10 and ×40 times; brown spots were location of H2O2). K1-K5：Alfalfa leaves of control pretreated with CAT; L1-L5：Alfalfa leaves soaked in MOPS buffer containing DAB.CAT+DAB: The controls soaked in CAT before dyeing with DAB; DAB: The samples dyed with DAB. M: Healthy alfalfa leaves coloring with DAB; N: Infected alfalfa leaves coloring with DAB.

2.2.2 苜蓿葉片中H2O2組織化學(xué)定位 接種豌豆白粉菌后，以DAB染色苜蓿葉片示蹤H2O2集聚位點(diǎn)(棕色著色點(diǎn))。以預(yù)先CAT酶液浸泡處理，再以DAB染色的葉片作為對(duì)照。如圖4所示，接種當(dāng)天，葉片葉脈清晰，葉面干凈(圖4K1，L1)；接種3 d后，葉片侵染處出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，即H2O2集聚位點(diǎn)(圖4L2)，至第7天，H2O2集聚點(diǎn)更多、更密集(圖4L3)；對(duì)照第7天葉片同樣觀察到HR壞死斑。將葉片制作成石蠟切片后，觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照葉片無(wú)色透明，葉緣難以辨識(shí)(圖4K4，K5)；而DAB染色的苜蓿葉片上、下表皮細(xì)胞胞壁均呈淺棕色，葉緣清晰(圖4M，N)；病原菌侵染處，皮下葉肉細(xì)胞著色更深，H2O2集聚濃度更大，葉肉細(xì)胞胞膜和細(xì)胞質(zhì)，甚至細(xì)胞核也染為深棕色，而相鄰未受害細(xì)胞著色很淺(圖4L4，L5)。說(shuō)明接種豌豆白粉菌后，上下表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜電子傳遞鏈和受害位點(diǎn)葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)都是細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生的重要位點(diǎn)。由于活性氧迸發(fā)是把雙刃劍，殺死入侵病原菌的同時(shí)，也會(huì)使自身組織受害。因此，苜蓿植株僅在白粉菌侵染點(diǎn)大量爆發(fā)H2O2，以抵御病原菌侵染，而在未受侵部位維持較低的H2O2濃度水平。此外，圖4N圖片顯示，菌絲侵染處，表皮下葉肉細(xì)胞變?yōu)榱藞A球形，柵欄組織和海綿組織細(xì)胞難以區(qū)分。

圖5 接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片HR壞死斑Fig.5 After inoculation with E. pisi, necrosis spots of HR in M. sativaO：0 d苜蓿葉片；P：過(guò)敏性反應(yīng)壞死病斑；Q：慶陽(yáng)苜蓿葉片壞死病斑；R：德寶苜蓿葉片壞死病斑。O: Alfalfa leaves at 0 day; P: Necrosis spots of hypersensitive reaction; Q: Necrosis spots in Qingyang alfalfa; R: Necrosis spots in Derby alfalfa.

圖6 接種豌豆白粉菌后，苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)變化Fig.6 After inoculation with E. pisi, the changes in anatomical structure of leaf in M. sativaS：接種0 d苜蓿葉片(×10)；T：接種0 d苜蓿葉脈(×10)；U：接種7 d苜蓿葉片(×10)； V：接種7 d苜蓿葉脈(×10)。S: Alfalfa leaves at 0 day after inoculation (×10); T: Main vein at 0 day after inoculation (×10); U: Alfalfa leaves at 7 day after inoculation (×10); V: Main vein at 7 day after inoculation (×10).

2.3 過(guò)敏性壞死

接種豌豆白粉菌后，按照一定的時(shí)間間隔取樣并固定在卡諾液中。更換2～3次卡諾液，葉片組織變得潔白，經(jīng)間苯三酚染色，木質(zhì)化的葉脈(主脈和次脈)變成了鮮艷的桃紅色至玫紅色(圖5O)。葉片表皮細(xì)胞呈不規(guī)則拼圖樣緊密相連(圖5P)。HR壞死處細(xì)胞壁加厚加粗，為枯黃色，并未染為紅色，說(shuō)明HR壞死處細(xì)胞壁加強(qiáng)并不是木質(zhì)化加厚(圖5P)。對(duì)抗性不同的兩苜蓿品種觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)論抗病性大小，葉片均出現(xiàn)或多或少的HR壞死(圖5Q，R)。

2.4 苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化

接種豌豆白粉菌前，紫花苜蓿葉片具有典型的異面葉的結(jié)構(gòu)，上、下表皮細(xì)胞之間是結(jié)構(gòu)明顯不同的兩種葉肉細(xì)胞——長(zhǎng)圓形的柵欄組織細(xì)胞和偏圓形的海綿組織細(xì)胞(圖6S，T)。柵欄細(xì)胞1層或1～2層，排列整齊像一道籬笆位于葉片近軸面；遠(yuǎn)軸面的海綿細(xì)胞3～4層分布均勻。病原菌侵染7 d后，葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨變。柵欄細(xì)胞由一個(gè)長(zhǎng)圓形細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)偏圓形小細(xì)胞，致使兩種葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)類似，難以區(qū)分(圖6U，V)。

3 討論

在不同病原物與寄主植物的互作反應(yīng)中，活性氧的積累通常表現(xiàn)出不同的時(shí)間變化特征和空間分布規(guī)律。在病原菌及植物源試劑的刺激下，懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞ROS的積累是雙階段的。快速、微弱而短暫的第一階段積累；緊跟著是一個(gè)持續(xù)的、大量的、且更重要的第二階段積累。第一階段的ROS積累與任何無(wú)毒或強(qiáng)毒病原菌對(duì)植物的侵染相關(guān)，這可能不依賴于ROS產(chǎn)生酶系統(tǒng)；而第二階段的ROS積累僅僅與強(qiáng)致病力的病原菌侵染有關(guān)，是一種依賴于增加了mRNA轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)反應(yīng)，這種mRNA編碼了ROS產(chǎn)生酶[27-28]。然而，這些對(duì)懸浮細(xì)胞的研究結(jié)論，由于細(xì)胞間缺乏相互的聯(lián)系，其ROS積累規(guī)律可能并不完全適用于植物與病原菌互作體系。

3個(gè)小麥品種在受到條銹菌侵染后發(fā)生的ROS迸發(fā)在植物抵御病菌侵染中具有關(guān)鍵作用，在非親和互作中，小麥CY-23 和 CY-25 中ROS 積累出現(xiàn)兩個(gè)峰值，分別在接種后第2天和第 5～6天[23]。在親和互作中，小麥CY-29 只有一個(gè)峰值出現(xiàn)，出現(xiàn)時(shí)間與非親和互作的第2個(gè)活性氧高峰期一致，且推測(cè)前期起作用的 ROS 主要是 H2O2，其作用是作為信號(hào)物質(zhì)激活細(xì)胞對(duì)病菌的包括 HR 在內(nèi)的防衛(wèi)反應(yīng)；而后期起作用的主要是·O2-，其作用是殺死病菌和細(xì)胞本身[23]。隨后，對(duì)小麥成株抗條銹病研究發(fā)現(xiàn)，在分蘗期和孕穗期小麥-條銹菌組合中，小麥葉片于接種后24 和36 h分別形成·O2-迸發(fā)高峰，24 h和72～96 h形成 H2O2迸發(fā)高峰；·O2-和H2O2迸發(fā)高峰出現(xiàn)時(shí)間雖不完全一致，但是具有相似的雙峰特征；而在苗期組合中，病菌的大多數(shù)侵染并沒(méi)有誘導(dǎo)·O2-和H2O2的產(chǎn)生[25]。以潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea)接種抗性水平不同的楊樹(shù)(Populusspp.)，兩種楊樹(shù)樹(shù)皮中的·O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)均有上升趨勢(shì)，抗病楊樹(shù)毛白楊(P.tomentosa)出現(xiàn)了較明顯的“氧化爆發(fā)”，感病楊樹(shù)北京楊(P.beijingensis)則不明顯[29]。本研究接種豌豆白粉菌后，抗性品種慶陽(yáng)苜蓿·O2-和H2O2迸發(fā)均呈雙峰形，第一次高峰出現(xiàn)在接菌后4 h，且迸發(fā)強(qiáng)度高于第二次高峰；而感病品種德寶苜蓿·O2-含量未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，H2O2迸發(fā)呈單峰形，僅在接菌后4 h出現(xiàn)一次迸發(fā)高峰。對(duì)于苜蓿-豌豆白粉菌互作體系研究，ROS迸發(fā)結(jié)果不完全與前人研究的植物-病原菌互作體系相同，活性氧迸發(fā)高峰出現(xiàn)時(shí)間早，接菌后4 h即出現(xiàn)第一次迸發(fā)高峰，且起主要作用的是H2O2；亦不同于前人對(duì)植物懸浮細(xì)胞-病原菌的研究結(jié)論，活性氧迸發(fā)的第一次高峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于第二次積累高峰。說(shuō)明不同植物種與病原菌互作中，活性氧積累的時(shí)間和強(qiáng)度均不相同，啟動(dòng)防御反應(yīng)的活性氧種類亦不同。圖3 F所示葉片上的藍(lán)色著色斑點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)是田間白虱取食傷口為NBT染色所致。說(shuō)明昆蟲(chóng)取食處有·O2-迸發(fā)產(chǎn)生，具體·O2-迸發(fā)為苜蓿抵御昆蟲(chóng)取食誘導(dǎo)自身產(chǎn)生，還是昆蟲(chóng)為突破防御所釋放?還待進(jìn)一步分析研究。

當(dāng)植物受到病原微生物侵染以后，通常在病原體入侵位點(diǎn)的細(xì)胞和一些鄰近細(xì)胞產(chǎn)生一種非常迅速的自發(fā)死亡的現(xiàn)象，形成壞死斑，從而阻止病害的進(jìn)一步發(fā)展，即過(guò)敏反應(yīng)(HR)[30-32]。HR由病菌侵襲的識(shí)別引發(fā)，緊跟著出現(xiàn)活性氧迸發(fā)，誘導(dǎo)了防御相關(guān)基因的表達(dá)和過(guò)敏性細(xì)胞死亡[32]。Delledonne等[33]發(fā)現(xiàn)，與NO互作引起過(guò)敏性細(xì)胞死亡的信號(hào)分子是由 SOD催化·O2-產(chǎn)生的H2O2，而非·O2-本身。以晚疫病菌Phytophthorainfestans接種馬鈴薯(Solanumtuberosum)，其葉片·O2-的積累水平與過(guò)敏性壞死細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)[34-35]。或許不同的植物-病原物互作體系，誘發(fā)HR的ROS種類并不完全一致。本研究發(fā)現(xiàn)，接種豌豆白粉菌后，抗病品種(慶陽(yáng)苜蓿)和感病品種(德寶苜蓿)葉片均出現(xiàn)了明顯的HR壞死斑，結(jié)合ROS迸發(fā)規(guī)律，分析發(fā)現(xiàn)苜蓿HR僅與H2O2積累有關(guān)，可能是H2O2第一次迸發(fā)高峰誘發(fā)了程序性細(xì)胞死亡(PCD)相關(guān)基因的表達(dá)，從而出現(xiàn)了HR壞死。且在HR壞死斑處，上表皮細(xì)胞壁加強(qiáng)，菌絲擴(kuò)展受到較明顯的抑制。一般來(lái)說(shuō)這種細(xì)胞壁的強(qiáng)化，一是由于細(xì)胞壁木質(zhì)化作用[36]；二是富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)等細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白和酚類物質(zhì)在細(xì)胞壁上的交錯(cuò)網(wǎng)狀沉積[16]。對(duì)受侵染苜蓿葉片以間苯三酚染色發(fā)現(xiàn)，HR壞死斑處的細(xì)胞壁不能染為紅色，說(shuō)明活性氧H2O2迸發(fā)可能引起了苜蓿表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生氧化交聯(lián)，從而強(qiáng)化了細(xì)胞壁，而非木質(zhì)化加厚。 HR處，胞壁加強(qiáng)限制了病原菌絲向鄰近細(xì)胞的擴(kuò)展，同時(shí)死亡的細(xì)胞不能持續(xù)為活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌提供營(yíng)養(yǎng)，從而抑制或延緩活體營(yíng)養(yǎng)型病原體的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。

首次發(fā)現(xiàn)，接種豌豆白粉菌后，紫花苜蓿葉片的柵欄組織細(xì)胞由一個(gè)長(zhǎng)圓形細(xì)胞變?yōu)槎鄠€(gè)偏圓形小細(xì)胞，增加了進(jìn)行光合作用的葉肉細(xì)胞層數(shù)，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和光合作用功能局域化，光合單位最小化，這可能是苜蓿抵御病原菌侵染的策略之一。柵欄組織細(xì)胞含有大量的葉綠體，是植物光合作用的重要場(chǎng)所，其體積大，在上表皮細(xì)胞下只有1層或1～2層。一旦病原菌侵染成功，損害柵欄組織細(xì)胞的光合作用功能，可能對(duì)植物造成巨大傷害。苜蓿葉片柵欄組織細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變可能規(guī)避這種風(fēng)險(xiǎn)，將病原菌對(duì)植物葉片光合作用的損害降低到最小，將功能發(fā)揮到最大。

[1] Chen W X. The role of legumes-root nodule bacteria nitrogen fixing system in development of west area of China. Acta Agrestia Sinica, 2004, 12(1): 12.

[2] Shi Y C. Extricate ourselves from the dilemma of desertification control and return of reclaimed farmland (to afforested area). Acta Agrestia Sinica, 2004, 12(2): 83-86.

[3] Yuan Q H. Advances in alfalfa diseases in China. Plant Protection, 2007, 33(1): 6-10.

[4] Liu R, Hou T J. A preliminary list of fungal diseases on forage legumes in northern China. Chinese Journal of Grassland, 1984, 1: 56-61.

[5] Nan Z B. Alfalfa diseases and their integrated control systems in our country. Animal Science & Veterinary Medicine, 2001, 18(4): M1-M4.

[6] Lv X L, Ai L, Yin Q S,etal. The investigation of the downy mildew of alfalfa. The Journal of Gansu Agricultural University, 1976, (3): 39-42.

[7] Nan Z B. The influence of rust disease on the nutritional ingredients ofMedicagosativa. Journal of Grassland and Forage in China, 1985, 3(2): 33-36.

[8] Geng H Z. Chinese Alfalfa[M]. Beijing: China Agriculture Press, 1995: 114-130.

[9] Hou T J, Zhou S Q. Influence of downy mildew on growth and root nodulation of seedlings of alfalfa. Grassland of China, 1997, 2: 52-54.

[10] Su S C, Wang X W, Wang C L,etal. Occurrence of common leafs pot of alfalfa in Xinjiang. Pratacultural Science, 1997, 14(5): 31-33.

[11] Yuan Q H, Li X L, Zhang W S. Studies onPseudopezizamedicaginisand its biological characteristics. Plant Protection, 2001, 27(1): 8-12.

[12] Lamb C, Dixon R A. The oxidative burst in plant disease resistance. Annual Review Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1997, 48: 251-275.

[13] Wojtaszek P. Oxidative burst an early plant response to pathogen infection. Biochemical Journal, 1997, 322: 681-692.

[14] Keppler L D, Baker C J.·O2-initiated lipid peroxidation in a bactia-induced hypersensitive reaction in tobacco cell suspension. Phytopathology, 1989, 79: 555.

[15] Keppler L D, Baker C J. Initiated lipid peroxidation in a bacteria induced hypersensitive reaction in tobacco suspension cells. Phytopathology, 1989, 79: 974-978.

[16] Wang L G, Li L. Role of reactive oxygen intermediates and nitric oxide in resistance to plant diseases. Chinese Bulletin of Botany, 2003, 20(3): 354-360.

[17] Guo Z J, Li D B. Active oxygen species in plant disease resistance. Acta Botanica Sinica, 2000, 42(9): 881-891.

[18] Sun D Y, Guo Y L, Ma W G. Cell Signal Transduction[M]. Beijing: Science Press, 1998: 245.

[19] Vianello A, Macri F. Generation of superoxide anion and hydrogen peroxide at the surface of plant cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 1991, 23: 409-423.

[20] Elstner E F. Mechanisms of Oxygen Activation in Different Compartments of Plant Cells[M]//Pelland E J, Steffen K L. Active Oxygen/Oxidative Stress in Plant Metabolism. Rockville: American Society of Plant Physiologists, 1991: 13-25.

[21] Apel K, Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, 2004, 55: 373-399.

[22] Lindqvist T, Kenne L, Lindeke B. On the chemistry of the reaction between N-acetylcysteine and 4-[(4-ethoxyphenyl)imino]-2,5-cyclohexadien-l-one, a 4-ethoxyanailine metabolite formed during peroxidase reactions. Chemical Research in Toxicology, 1991, 4: 489-496.

[23] Long S S, Cao Y L, Li Y L,etal. Metabolism of reactive oxygen species in the process of hypersensitive response of wheat to stripe rust. Journal of Northwest A & F University: Natural Sciences Edition, 2009, 37(11): 125-131.

[24] Wang C F. Studies on Histology and Cytochemistry of Oxidative Burst during Wheat-PucciniastriiformisF.SP. Tritici Interaction[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2008.

[25] Zhang H C. Histological and Cytological Analyses of Adult Plant Resistance to Wheat Stripe Rust and Characterization of Non-host Resistances of Wheat to Uromyces Fabae[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2012.

[26] Patterson B D, Macrae E A, Ferguson I B. Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using titanium (Ⅳ). Analytical Biochemistry, 1984, 139: 487-492.

[27] Miguel A T, Jonathan D G, Jones J L. Reactive oxygen species signaling in response to pathogens. Plant Physiology, 2006, 141: 373-378.

[28] Liu X M, Williams C E, Nemacheck J A,etal. Reactive oxygen species are involved in plant defense againstGallmidge. Plant Physiology, 2010, 152: 985-999.

[29] Wang Y, Liang J, Zhang X Y. Changes of active oxygen and related enzymes during the interaction of poplar and canker disease pathogen. Journal of Nanjing Forestry University: Natural Sciences Edition, 2008, 32(5): 41-46.

[30] Lam E. Controlled cell death, plant survival and development. Nature Reviews in Molecular Cell Biology, 2004, 5: 305-315.

[31] Van B F, Dat J F. Reactive oxygen species in plant cell death. Plant Physiology, 2006, 141: 384-390.

[32] Hiroshi Y, Kazuki F, Hideyuki T,etal. Polyamines as a common source of hydrogen peroxide in host- and nonhost hypersensitive response during pathogen infection. Plant Molecular Biology, 2009, 70: 103-112.

[33] Delledonne M, Zeier J. Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen inter mediates in the plant hypersensitive disease resistance response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98: 13454-13459.

[34] Chai H B, Doke N. Activation of the potential of potato leaf tissue to react hypersensitive toPhytophthorainfestanscytospore germination fluid and the enhancement of this potential by calcium ions. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1987, 30: 27.

[35] Doke N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissue to infection with an incompatible race ofPhytophthorainfestansand to the hyphal wall component. Physiological Plant Pathology, 1983, 23: 345.

[36] Collendavelloo J, Legrand M, Fritig B. Plant disease and the regulation of enzymes involved in lignification-increased rate of de novo synthesis of the three tobacco O-Methyltransferases during the hypersensitive response to infection by tobacco mosaic virus. Plant Physiology, 1983, 73: 550-554.

[1] 陳文新. 豆科植物根瘤菌固氮體系在西部大開(kāi)發(fā)中的作用. 草地學(xué)報(bào), 2004, 12(1): 12.

[2] 石元春. 走出治沙與退耕中的誤區(qū). 草地學(xué)報(bào), 2004, 12(2): 83-86.

[3] 袁慶華. 我國(guó)苜蓿病害研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2007, 33(1): 6-10.

[4] 劉若, 侯天爵. 我國(guó)北方豆科牧草真菌病害初步名錄. 中國(guó)草地學(xué)報(bào), 1984, 1: 56-61.

[5] 南志標(biāo). 我國(guó)的苜蓿病害及其綜合防治體系. 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué), 2001, 18(4): M1-M4.

[6] 呂新龍, 艾里, 殷啟失, 等. 苜蓿霜霉病的調(diào)查研究. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1976, (3): 39-42.

[7] 南志標(biāo). 銹病對(duì)紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分的影響. 中國(guó)草原與牧草, 1985, 3(2): 33-36.

[8] 耿華珠. 中國(guó)苜蓿[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1995: 114-130.

[9] 侯天爵, 周淑清. 霜霉病對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響. 中國(guó)草地, 1997, 2: 52-54.

[10] 蘇生昌, 王雪薇, 王純利, 等. 苜蓿褐斑病在新疆的發(fā)生. 草業(yè)科學(xué), 1997, 14(5): 31-33.

[11] 袁慶華, 李向林, 張文淑. 苜蓿假盤(pán)菌及其生物學(xué)特性的研究. 植物保護(hù), 2001, 27(1): 8-12.

[16] 王利國(guó), 李玲. 活性氧中間體和NO在植物抗病中的作用. 植物學(xué)通報(bào), 2003, 20(3): 354-360.

[17] 郭澤建, 李德葆. 活性氧與植物抗病性. 植物學(xué)報(bào), 2000, 42(9): 881-891.

[18] 孫大業(yè), 郭艷林, 馬文耕. 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998: 245.

[23] 龍書(shū)生, 曹遠(yuǎn)林, 李亞玲, 等. 小麥抗條銹病過(guò)敏性壞死反應(yīng)中的活性氧代謝. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 37(11): 125-131.

[24] 王晨芳. 小麥與條銹菌互作過(guò)程中活性氧迸發(fā)的組織學(xué)和細(xì)胞化學(xué)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2008.

[25] 張宏昌. 小麥成株抗條銹病的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究及小麥非寄主抗蠶豆銹病的機(jī)理研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2012.

[29] 王媛, 梁軍, 張星耀. 抗、感病楊樹(shù)與潰瘍病菌互作中活性氧及相關(guān)酶的動(dòng)態(tài). 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 32(5): 41-46.

The effect ofErysiphepisiinfection on the pattern of oxidative burst and on anatomic structure of leaves inMedicagosativa

ZHANG Yong-Mei1,2, MA Hui-Ling2, TANG Yun-Zhi2

1.InstrumentalResearch&AnalysisCenter,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.PrataculturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Medicagosativawas inoculated withErysiphepisi. The colorimetric method was used to study the timing and intensity of·O2-and H2O2bursts in leaves, and histochemical methods were used to study localization of·O2-and H2O2accumulation. In addition, paraffin sections were made from infected leaves to observe structural changes in those leaves. It was found that after inoculation,·O2-and H2O2bursts in Qingyang alfalfa (resistant cultivar) were observed as two peaks, appearing 4 and 48 h after inoculation for·O2-and 4 and 24 h after inoculation for H2O2, respectively, with the intensity of the first peak higher than that of the second peak. By contrast, in Debao alfalfa (susceptible cultivar), no obvious fluctuation in·O2-content appeared and only the one peak for H2O2accumulation was seen. Staining to reveal zones of localization of reactive oxygen species (ROS) showed that blue-stained·O2-deposition sites did not occur at the surface of or inside of leaves, while brown-stained H2O2deposition sites were observed in the cell wall of upper and lower epidermal cells, and the cytoplasm of infected mesophyll cells. Most importantly, we report here for the first time that the tissue structure of alfalfa leaves was changed after infection withE.pisi. Palisade cells changed from a long-cylindrical cell type to groups of several subrotund cells, so that it was difficult to distinguish the palisade tissue and spongy tissue cells. Our results show that for the different plant species and pathogen resistance combinations investigated, the timing and intensity of ROS accumulation differed, as did the identity of the chemical species generated in activating the defense reaction. The structural and morphological change of mesophyll cells may be one component of an effective response against powdery mildew infection inM.sativa.

hydrogen peroxide; superoxide anion; hypersensitive response; anatomic structure

10.11686/cyxb2016011

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-01-06；改回日期：2016-03-08

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金 (GSAU-STS-1343) 和“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃專題(2012BAD12B02-4)資助。

張?jiān)伱?1974-)，女，甘肅武威人，副研究員，博士。E-mail:zym824@sina.com

張?jiān)伱? 馬暉玲, 唐云智. 豌豆白粉菌侵染對(duì)活性氧迸發(fā)規(guī)律和紫花苜蓿葉片結(jié)構(gòu)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 34-42.

ZHANG Yong-Mei, MA Hui-Ling, TANG Yun-Zhi. The effect ofErysiphepisiinfection on the pattern of oxidative burst and on anatomic structure of leaves inMedicagosativa. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 34-42.