胚胎脊髓移植結合神經生長因子對損傷脊髓老年大鼠的修復作用

解錦鼎 安 寧 曹文慧 楊曉帆 李小蘋

(牡丹江林業中心醫院骨科，黑龍江 牡丹江 157000)

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胚胎脊髓移植結合神經生長因子對損傷脊髓老年大鼠的修復作用

解錦鼎 安 寧1曹文慧1楊曉帆1李小蘋1

(牡丹江林業中心醫院骨科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 分析胚胎脊髓移植(FSC)結合神經生長因子修復損傷脊髓的老年大鼠模型。方法 將28只體重250～300 g的健康Wistar大鼠用于制作脊髓損傷模型，其中和雙下肢癱瘓標準相符的24只分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結合外源性神經生長因子組(B組)、脊髓損傷結合FSC組(C組)、脊髓損傷結合FSC兼用神經生長因子組(D組)4組，每組6只。將10 μl移植物注入B、C、D組體內。結果 B、C、D組移植手術后2、4、6、8 w的聯合行為評分(CBS)、神經元面積均顯著低于或高于A組(P<0.05)，D組移植手術后2、4、6、8 w的CBS、神經元面積顯著低于或高于B、C組(P<0.05)。結論 FSC結合神經生長因子能夠有效修復老年大鼠的損傷脊髓功能。

胚胎脊髓移植；神經生長因子；損傷脊髓

脊髓損傷引發的神經元萎縮是否能夠在胚胎脊髓移植(FSC)結合神經生長因子的作用下得到挽救、大鼠脊髓損傷后的功能是否能夠在其作用下得到恢復及二者的協同作用尚不清楚，本實驗分析FSC結合神經生長因子修復損傷脊髓老年大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：自制改良Allen打擊器、病理切片機OPTICKI型(Japan)、光學顯微鏡CX40RF200型(Olympus Optical Co.LTD Japan)、離心機LXZ-64-01型(北京醫療儀器廠)、計算機圖像分析儀MIAS-2000型(四川大學圖像研究所)。主要試劑：自制胚胎脊髓懸液、Nissl染色試劑(甲苯藍試劑，北京化工制品有限公司)、神經生長因子(北京圣日醫藥科技發展有限公司)。Wistar孕鼠(第1天：陰栓出現2 w后剖腹將胚胎脊髓取出)、Wistar大鼠(山西醫科大學實驗動物中心)。

1.2 模型制作及分組 28只體重250～300 g的健康Wistar大鼠給予腹腔注射750 mg/kg 20%烏拉坦進行麻醉，幫助其取俯臥位，在手術板上固定，用碘伏常規備皮消毒。將無菌巾鋪上，在以T7棘突為中心的背正中縱行開一長4 cm的切口，切開皮下組織對兩側椎旁肌進行剝離。將T7棘突及椎板切除，將硬膜暴露，將有直徑為2 cm打擊頭的改良Allen打擊器放置其中，對重量為10 g的打擊重錘進行調節，高度為5 cm。使重錘自然下落，將打擊重量保持在50 g/cm2。以較快的速度將打擊頭及重錘移開，對創面進行清理，將切口逐層縫合起來。單籠飼養動物，定時為其擠尿，每8 h 1次，喂養3 d，期間4只死亡。余下的24只與雙下肢癱瘓標準相符，分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結合外源性神經生長因子組(B組)、脊髓損傷結合FSC組(C組)、脊髓損傷結合FSC兼用神經生長因子組(D組)4組，每組6只。

1.3 移植方法 將制作脊髓損傷動物模型取出來，將損傷脊髓處硬膜暴露，途徑為手術入路；將皮試注射器向損傷中心垂直刺入，抽取少量滲液，抽取過程中以較慢的速度；將移植物取出，在此過程中用皮試注射器，分別刺入頭尾1.5 cm，位置為損傷中心，刺入角度為45°斜角，3 min內勻速將10 μl移植物注入B、C、D組體內；對滲出情況進行嚴密觀察，然后逐層縫合，單籠飼養，定時為其擠尿，每8 h 1次，完成標準為其能夠自行排尿。

1.4 聯合行為評分(CBS) 制模術后6 h、移植術后2、4、6、8 w分別對脊髓損傷后運動、反射等后肢功能進行綜合評定，評定過程中運用Cale綜合評分方法，分值在0～100分，大鼠的神經功能和分值呈顯著的負相關關系，即0分為具有完全正常的神經功能，100分為完全喪失神經功能〔1〕。

1.5 形態學檢查 ①標本取材。將大鼠處死，將其脊髓標本切取，計所有時相點，每組3只。給予大鼠750 mg/kg 20%烏拉坦麻醉，幫助大鼠取仰臥位，在手術板上固定，開胸將其心臟暴露，進行主動脈插管，切開右心房，將生理鹽水灌注其中，改用10%甲醛溶液灌注的標準為有無色液體從右心房切口溢出，停止灌注的標準為刺激性氣體從右心房切口溢出2 min后，2 h后從原手術入路將T7暴露出來，計T4～T10椎體，分別切片并進行HE、甲苯胺藍、嗜銀染色，位置為所有標本頭尾兩側及損傷中心；②光鏡觀察。HE染色切片、甲苯胺藍染色切片、嗜銀染色切片分別對神經元細胞數量及大小、神經元細胞軸突發芽及尼氏小體、神經纖維變化情況進行觀察，然后對神經元面積變化進行檢測和定量分析，檢測過程中用計算機圖像分析儀〔2～5〕。

1.6 統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1 4組移植手術后2、4、6、8 w的CBS變化 B、C、D組移植手術后2、4、6、8 w的CBS均顯著低于A組(P<0.05)，D組移植手術后2、4、6、8 w的CBS又均顯著低于B、C組(P<0.05)，但B、C組差異均不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 4組移植手術后2、4、6、8 wCBS變化(分，

與A組比較：1)P<0.05；與D組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 4組移植手術后2、4、6、8 w的神經元面積變化 B、C、D組移植手術后2、4、6、8 w的神經元面積均顯著高于A組(P<0.05)，D組移植手術后2、4、6、8 w的神經元面積又均顯著高于B、C組(P<0.05)，但B組、C組差異均不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 4組移植手術后2、4、6、8 w的神經元面積變化

3 討 論

由于哺乳動物中樞神經損傷后再生極為困難，因此平面以下下肢癱瘓在脊髓損傷的作用下發生一直是臨床研究的難點和重點〔6〕。醫學實驗表明〔7～10〕，脊髓損傷后由于缺乏對促進神經再生進行誘導的微環境等，因此無法再生，這和周圍神經不同。醫學實驗顯示〔11，12〕，宿主脊髓中胚胎脊髓移植能夠存活、生長等并促進部位纖維連接的形成，為恢復神經功能提供良好的前提條件。對其應用外源性神經營養因子能夠對脊髓神經元萎縮進行有效防止，促進紅核脊髓通路的再生。在神經營養因子中，最具感覺及運動神經元活性的是神經生長因子。FSC及外源性神經生長因子均能夠有效改善脊髓損傷局部微環境，將良好的前提條件提供給損傷脊髓的神經纖維再生。本研究結果充分說明FSC結合神經生長因子能夠有效修復老年大鼠的損傷脊髓功能。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯 苑云杰)

牡丹江醫學院科學技術研究項目(No.ZS201523；ZS201526)

安 寧(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事神經病學研究。

解錦鼎(1982-)，男，碩士，主治醫師，主要從事脊髓損傷研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)21-5269-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.024

1 牡丹江醫學院紅旗醫院神經內科