H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫院呼吸內科，浙江 麗水 321400)

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H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用

李 露 曹 卓 潘炯偉 王 潔

(麗水市人民醫院呼吸內科，浙江 麗水 321400)

目的 探討H2松弛素對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支氣管平滑肌增殖的抑制作用。方法 觀察正常對照組、COPD模型組及松弛素治療組大鼠肺組織的病理變化，比較各組大鼠支氣管壁及平滑肌厚度，檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 表達水平及MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值。結果 與正常對照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達水平均高于正常對照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與正常對照組相比，呈現明顯升高趨勢(P<0.05)；而對比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。結論 松弛素能抑制大鼠肺組織結構病理變化，抑制COPD氣道平滑肌的增殖。

松弛素；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；基質金屬蛋白酶(MMP)；基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的致病因素很多，其發病機制尚不明確〔1〕。國外研究〔2〕證實，當小鼠缺乏H2松弛素時，會表現出肺部變性，質量增加，生成大量膠原及纖維，肺泡產生病理改變，出現充血，可伴有水腫，同時支氣管上皮細胞出現增厚等病理變化，出現類似衰老的表現，因此補充H2松弛素可使得上述病理變化出現逆轉，且發現這一病理變化過程極有可能通過影響了肺及平滑肌中基質金屬蛋白酶 (MMP)-1、MMP-9及MMP組織抑制劑(TIMP)-1的表達而實現。本實驗采用脂多糖(LPS)滴注大鼠氣道，聯合被動吸煙法制備COPD的大鼠模型〔3〕，探討H2松弛素對COPD模型中大鼠的支氣管平滑肌增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 選取鼠齡12 w、體質量(200±20)g的 Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組、COPD模型組和松弛素治療組。COPD模型組和松弛素治療組分別于造模的第1以及第15天，向大鼠的氣道內滴注一定量的LPS，濃度為200 μg/200 μl，正常對照組不作任何處理。造模第2天將COPD模型組和松弛素治療組大鼠放入有機玻璃熏箱內，每次吸煙10支，大約2 h，每天吸煙2次(上、下午各一次)，每周吸煙6 d，共吸煙20 w。松弛素治療組在造模開始第30天開始每天皮下注射松弛素(0.25 mg·kg-1·d-1)15 d，正常對照組采用生理鹽水注射15 d。檢測模型制定成功的標準：隨機選取COPD造模組大鼠，切取肺組織做病理分析，觀察其肺部組織是否出現類似COPD的病理變化。大鼠肺部的外周氣道、主支氣管及細支氣管以及血管壁均出現炎細胞浸潤，氣道損傷；鏡下可見黏液腺肥大增生，杯狀細胞增多；平滑肌以及肺小動脈平滑肌均出現增生，膠原沉積進而出現氣道腔縮小狹窄，導致氣道出現阻塞；出現細支氣管呼吸相擴張、受損，肺泡因壓力導致增大，形成不規則的肺大泡。

1.2 收集標本 采用濃度(50 mg/kg)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后斷頭處死，取材部位為：心、右下肺葉，所有組織儲存于液氮罐中。向左側主支氣管注入4%多聚甲醛，致使大鼠出現輕度肺膨脹，按照0.5 cm厚度切取左側中下肺葉，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，采用石蠟垂直包埋，垂直于支氣管及細支氣管橫斷面、矢狀位切片。HE染色行病理學觀察。同時測量各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度。

1.3 檢測大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達 采用免疫組織化學過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)測定。鏡下結果采用圖像分析系統統計，隨機挑選鏡下6個畫面，當細胞質及胞膜出現棕褐色顆粒則計為陽性表達，采用平均吸光度值測定表達強度，吸光度值越高提示所測指標含量越高。試劑盒采用美國Zymed公司SP試劑盒。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺-支氣管的病理學變化 正常對照組大鼠鏡下可見肺結構大體正常，肺小葉結構組織無明顯異常，支氣管未見明顯異常；COPD模型組大鼠細支氣管纖毛部分出現滑落，粘連，倒伏，黏液腺較正常大鼠增大，杯狀細胞及嗜酸性細胞浸潤增多，管壁明顯增厚，管腔狹窄，伴有大量中性粒細胞、漿細胞及淋巴細胞的浸潤，上皮細胞膨脹出現變形、細胞壞死傾向，肺泡間隔較正常肺泡變薄、部分出現斷裂，肺泡腔增大，甚至出現融合，松弛素治療組大鼠肺部組織也出現上述病理變化，但程度較COPD模型組大鼠病理改變減輕。

2.2 各組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度比較 與正常對照組大鼠相比，COPD模型組大鼠肺支氣管壁及平滑肌厚度顯著增厚，且松弛素治療組大鼠肺支氣管壁厚度及平滑肌厚度與COPD模型組大鼠相比顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達水平 COPD模型組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三者的表達水平均高于正常對照組(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與正常對照組相比，呈現明顯升高趨勢(P<0.05)；而對比COPD模型組大鼠，松弛素治療組大鼠組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的表達有所降低(P<0.05)，且MMP-1/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的比值與COPD模型組相比均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺支氣管壁及平滑肌厚度、肺組織MMP-1、MMP-9、TIMP-1 表達水平比較±s,n=10)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與COPD模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

MMPs是一組降解肺組織細胞外基質的最主要的酶系，可降解肺泡壁中全部細胞外基質成分，激活其他不同類型的MMPs等作用。TIMPs為一種內源性抑制劑，可抑制MMPs的活化〔6〕。TIMPs可由上皮細胞、內皮細胞等產生，是MMPs的內源性抑制劑，具備生長因子樣作用，可促使成纖維細胞增生，使細胞外基質沉積并抑制其降解。TIMPs與MMPs兩者以共價鍵形式形成復合體，進而阻止MMPs與相應底物結合，而TIMPs與MMPs這種結合具有不可逆性〔7〕。MMPs/TIMPs的比例改變是導致COPD氣道重塑的主要機制之一，而當COPD發生時，肺組織結構改變，如支氣管壁增厚，平滑肌增厚，從而導致功能下降，氣道發生不可逆改變，通氣功能下降，病理發現，支氣管壁以及平滑肌中出現大量炎癥細胞，嗜酸性粒細胞浸潤，原有結構發生改變，膠原沉積，纖維化改變等，以上均是導致支氣管功能下降的主要因素。

Comer等〔8〕研究顯示，在對比健康者和肺氣腫患者肺泡巨噬細胞中mRNA水平和蛋白酶的活性后發現，吸煙者肺部間質中膠原酶和巨噬細胞的明膠酶B表達增多，肺氣腫患者肺泡巨噬細胞的活性顯著增高。Segura-Valdez等〔7〕發現在肺氣腫患者肺組織中MMP-1高表達，MMP-9的表達在吸煙相關的肺氣腫中也呈現明顯增高，Raulo等〔9〕發現COPD表現的馬的支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的表達水平明顯高于健康馬，且與炎癥細胞呈正相關。TIMP-1廣泛存在于人體組織及血液中，具有較高的結合力，可與所有的MMPs家族成員形成復合物，從而抑制MMP-9的活性，進而導致蛋白水解酶活性喪失。TIMP-1的表達是否異常關系到肺部組織結構重塑〔10〕，研究發現TIMPs還具促細胞因子樣作用，促進細胞外基質沉積并抑制降解，其過程與氣道修復、重塑相近。松弛素屬于胰島素類生長激素家族的蛋白激素，其結構和胰島素相似，分子大小約6 kD，含有A和B兩個肽鏈，由二硫鍵連接組成〔4〕。研究發現，松弛素與其受體結合時，可致使其受體發生構象的改變，導致松弛素受體被激活，此激活途徑，進一步引起受體內細胞內信號轉導通路出現激活〔5〕。目前發現的松弛素基因，分別為H1、H2和H3，而H2主要存在于其組織及血液循環系統中。當松弛素與其受體結合時，血管內皮MMPs的活性可相應增強。

本研究提示COPD模型復制成功，大鼠出現肺部組織結構破壞，支氣管壁及平滑肌厚度顯著增加，且修復重構也同時進行，此結果與目前研究認為MMPs和TIMPs的動態平衡與氣道及肺組織破壞與修復同時存在相一致的理論〔11〕。而MMPs和TIMPs表達是否平衡是導致大鼠肺部各組織結構正常與否及維持細胞外基質正常的基礎條件之一，兩者失衡會出現病理變化。MMPs/TIMPs比值增加提示組織破壞加劇，下降則提示組織纖維化氣道重塑。

國外研究〔12〕證實松弛素缺失的小鼠會出現與衰老相關的膠原含量增加、肺組織質量增加、肺泡充血和細支氣管壁增厚，平滑肌增厚功能下降，而通過H2松弛素的治療可以使過多的膠原沉積得到逆轉。本實驗提示H2松弛素可能是通過抑制COPD氣道平滑肌的增殖，延緩COPD的進展，進而起到一定程度的治療作用。

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2 McGowan BM，Minnion JS，Murphy KG，etal.Central and peripheral administration of human relaxin-2 to adult male rats inhibits food intake 〔J〕.Diabetes Obes Metab，2010；12(12)：1090-6.

3 許三林，湯光宗，錢敏玉，等.實驗性吸煙小鼠氣道上皮細胞凋亡與慢性阻塞性肺疾病發生機制的研究〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2003；3(3)：169-73.

4 Teerlink JR，Cotter G，Davison BA，etal.Serelaxin，recombinant human relaxin-2，for treatment of acute heart failure (RELAX-AHF)：a randomised，placebo-controlled trial〔J〕.Lancet.2013；381(9860)：29-39.

5 韓曙光，呂蓓麗，丁曉婧，等.H2型松弛素對慢性支氣管哮喘小鼠氣道重塑與肺組織組織周期蛋白D1表達的影響〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2012；35(5)：349-54.

6 趙 華，趙 瑾，許西琳.COPD大鼠模型氣道MMP-9和TIMP-1表達的研究〔J〕.現代生物醫學進展，2010；12(10)：2244-6.

7 Segura-Valdez L，Pardo A，Gaxiola M，etal.Up-regulation of gelatinases A and B，collagenases 1 and 2，and increased parenchymal cell death in COPD〔J〕.Chest，2000；117(3)：684-94.

8 Comer D，Kidney J，Ennis M，etal.Airway epithelial cell apoptosis and inflammation in COPD，smokers and non-smokers〔J〕.Eur Respir J，2012；9(9)：1342-7.

9 Raulo SM，Sorsa T，Tervahartiala T，etal.MMP-9 as a marker of inflammation in tracheal epithelial lining fluid (TELF) and in bronchoalveolar fluid (BALF)of COPD horses〔J〕.Equine Vet J，2001;33(2)：128-36.

10 Tanaka H，Miyazaki N，Oashi K，etal.Sputum matrix metalloproteinase-9：tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio in acute asthma〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2000；105(5)：900-5.

11 Mercer PF，Shute JK，Bhowmik A，etal.MMP-9，TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation〔J〕.Respir Res，2005；6(1)：151.

12 Lee JH，Lee DS，Kim EK，etal.Simvastatin inhibits cigarette smoking induced emphysema and pulmonary hypertension in rat lungs〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005；172(8)：987-93.

〔2015-07-19修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

李 露(1987-)，女，住院醫師，主要從事肺部感染、肺癌研究。

R56

A

1005-9202(2016)21-5251-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.016