枸櫞酸預處理對缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表達的影響

李艷芳 費麗萍 牛青英 韓澤紅

(長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院心內科，山西 長治 046011)

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枸櫞酸預處理對缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Capase-3表達的影響

李艷芳 費麗萍 牛青英 韓澤紅1

(長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院心內科，山西 長治 046011)

目的 探討枸櫞酸預處理對心肌缺血再灌注(I/R)大鼠室性心律失常的影響及相關作用機制。方法 選擇雄性SD大鼠350～400 g，隨機分為假手術組、模型組、枸櫞酸組(0.05 mol/L)，每組10只，采用結扎冠狀動脈左前降支法建立在體大鼠I/R模型，缺血30 min，再灌注120 min，記錄心電圖，檢測預處理前后血清鈣離子濃度變化，TTC染色法測定梗死面積，活性分光光度法測定心肌組織Caspase-3蛋白表達水平，PCR測定心肌鈣調蛋白(CAM)表達水平。結果 模型組室性心律失常次數顯著高于假手術組(P<0.05)，枸櫞酸組低于模型組、高于假手術組(P<0.05)；枸櫞酸處理后血清鈣離子濃度顯著低于處理前(P<0.05)，有一定時間規(guī)律；枸櫞酸組梗死面積顯著低于模型組(P<0.05)，Caspase-3蛋白、CAM表達水平顯著低于模型組(P<0.05)。結論 枸櫞酸對I/R大鼠心肌保護作用與降低血清鈣離子濃度，下調Caspase-3蛋白、CAM表達水平，降低心肌細胞凋亡，減輕室性心律失常有關。

枸櫞酸；室性心律失常；Capase-3

心肌缺血再灌注(I/R)可加重缺血導致的心功能障礙與心肌細胞損傷，闡明其作用機制對于預防心肌I/R損傷有重要作用〔1〕。細胞內鈣超載在心肌I/R損傷中具有主導作用〔2〕，細胞內Ca2+失衡導致Ca2+分隔與Ca2+內流失調，引發(fā)心肌細胞內Ca2+超載，心肌缺血缺氧時線粒體產生ATP減少，鈣泵功能受限制，Na+/Ca2+交換蛋白為非ATP依賴性轉運蛋白，導致細胞內Na+水平增加及酸中毒，心肌再灌注時pH與ATP恢復，細胞內外pH梯度差激活Na+/H+與Na+/Ca2+交換，胞外Ca2+內流，導致細胞內鈣超載，在心肌動作電位后短暫除極，引發(fā)室性心律失常〔3〕。枸櫞酸多作為血液抗凝劑，可與Ca2+形成絡合物枸櫞酸鈣，降低血中Ca2+，抑制凝血過程。本研究觀察枸櫞酸預處理對I/R大鼠室性心律失常、血清Ca2+濃度及心肌組織Caspase-3蛋白、心肌鈣調蛋白(CAM)表達水平的影響，從分子水平探討其在I/R損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選擇健康雄性10周齡的SD大鼠，體重350～400 g，由中國醫(yī)學科學院動物實驗中心提供(許可證號：SYXK-2013-0025)，SPF級動物實驗室，飲食進水均符合實驗動物標準。隨機分為假手術組、模型組、枸櫞酸組，每組10只。枸櫞酸組在再灌注前10 min尾靜脈注射枸櫞酸0.05 mol/L，給藥體積為1 ml(按照臨床成人用量等效劑量換算)，后用50 μl生理鹽水插管，假手術組、模型組給予等體積生理鹽水。

1.1.2 試驗藥物與試劑 枸櫞酸(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC)、烏拉坦(購自于Sigma公司)，每個標本0.1 g TTC溶于5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，現配現用，避光。Caspase-3試劑盒(購自南京碧波生物科技公司)，BCATM Protein Assay Kit(23337，Pierse.USA)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參考文獻方法建立大鼠I/R模型〔4〕。采用5%烏拉坦腹腔麻醉，尾靜脈置入24G套管留置針，大鼠仰位固定，連接肢體導聯心電圖(ECG)Ⅱ導聯，頸部氣管切開置管連接小動物呼吸機控制大鼠呼吸(潮氣量8 ml/kg，呼吸頻率70次/min，吸呼比1∶2)，分離左頸總動脈，將硬膜外麻醉導管插入連接電生理信號記錄儀，左冠狀動脈前降支根部穿結扎線，假手術組只穿線不結扎冠狀動脈，其余各組均缺血30 min后再灌注2 h，記錄心電圖變化。缺血模型判斷：左冠狀動脈前降支結扎5 min后，Ⅱ導聯ST抬高或QRS波群振幅增加、增寬與T波融合；動脈血壓降低>20 mmHg，結扎血管支配區(qū)室壁發(fā)紺。再灌注模型判斷：缺血區(qū)發(fā)紺消失，再灌注30 min后抬高ST段降低>50%；排除再灌注前嚴重房室傳導阻滯，結扎前平均動脈壓<60 mmHg。大鼠缺血再灌注120 min ECG記錄中出現室性心律失常：室性早搏高峰期1～5 min、15～19 min、35～55 min。處死大鼠，取心組織，測定預處理前后血清Ca2+濃度，TTC染色法測定梗死面積，活性分光光度法測定心肌組織Caspase-3蛋白表達水平，PCR測定CAM表達水平。

1.2.2 TTC染色法測定梗死面積 取心臟PBS沖洗后取左心室于-80℃冰凍5 min后切片，置于1%pH 8.5的TTC溶液，37℃孵育0.5 h，梗死區(qū)域未著色，正常組織染成紅棕色，采用Image pro plus6.0軟件分析梗死面積，計算左室缺血面積占左心室面積百分比(AAR/LV)。

1.2.3 分光光度法測定心肌組織Caspase-3活性 取心臟左室部分缺血區(qū)心肌組織，制備心肌組織勻漿，BCATM Protein Assay Kit法測定蛋白水平，比色法測定心肌組織Caspase-3活性，按照試劑盒說明書測定。

1.2.4 PCR法測定CAM蛋白表達 以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，CAM序列正向引物：5'-GCTGCCTCTTCAAAATCGCC-3'，反向引物：5'-CTCTGCACTGTGTACCTCGG-3'。采用實時熒光定量PCR儀檢測，20 μl PCR反應體系，50℃ 2 min，95℃ 10 min后循環(huán)40次(95℃ 30 s，60℃ 30 s)，60℃采集熒光信號。

2 結 果

2.1 枸櫞酸預處理對室性期前收縮發(fā)生次數、聯律、室速、室顫發(fā)生的影響 與對照組比較，模型組室性期前收縮發(fā)生次數明顯增加(P<0.05)，枸櫞酸組室性早搏次數與模型組比較降低(P<0.05)。與模型組比較，枸櫞酸組聯律、室速的平均發(fā)生次數顯著降低(P<0.05)。模型組室顫發(fā)生率為10%，發(fā)生次數為1次，持續(xù)時間為10.45 s，其余各組無室顫發(fā)生。見表1。

表1 枸櫞酸預處理對室性早搏發(fā)生次數、聯律、室速發(fā)生情況影響±s,次,n=10)

與假手術組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 枸櫞酸預處理對血清Ca2+濃度的影響 枸櫞酸預處理后血清Ca2+濃度低于預處理前，干預10 min后達峰谷，干預30 min后血清Ca2+濃度上升。見圖1。

圖1 枸櫞酸預處理對血清Ca2+濃度的影響

2.3 枸櫞酸預處理對I/R大鼠心肌梗死AAR/LV、心肌組織Caspase-3蛋白表達的影響 枸櫞酸組AAR/LV顯著低于模型組(P<0.05)。假手術組Caspase-3表達水平為1，與模型組比較，枸櫞酸組Capase-3顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 枸櫞酸預處理對心肌梗死AAR/LV、心肌組織Capase-3蛋白表達影響

2.4 枸櫞酸預處理對I/R大鼠心肌組織CAM表達影響 與假手術組比較，模型組CAM表達顯著升高，枸櫞酸組CAM表達明顯降低。見圖2。

圖2 枸櫞酸預處理對I/R大鼠心肌組織CAM表達影響

3 討 論

心肌I/R損傷導致惡性心律失常，心肌梗死后發(fā)生心律失常重要原因為心室電重構，心肌細胞膜離子通道結構與功能變化在心律失常發(fā)生過程中有重要作用〔5～7〕，L-Ca2+通道開放及動作電位延長引起早后除極，鈣超載在心肌I/R心律失常病理過程中具有重要作用，缺血缺氧Na+-K+ATP酶活性下降，Na+-H+交換增加，胞內Na+超載，引發(fā)Na+-Ca2+交換，缺氧ATP生成減低，抑制肌漿網攝取及釋放Ca2+，胞質Ca2+積聚，再灌注時補充了高能磷酸化合物，肌漿網攝取釋放Ca2+，細胞內堆積大量鈣離子，延遲后除極幅度升高，引發(fā)室性心律失?！?～10〕。本研究結果表明，枸櫞酸可抑制大鼠I/R時室性心律失常。

心肌細胞L型鈣通道電流主要離子成分為Ca2+，L-Ca-L作為主要內心離子流參與心肌細胞動作電位復極化及竇房結起搏過程，激活肌漿網釋放Ca2+，維持正常心律，參與心肌細胞興奮-收縮耦聯與心肌細胞電活動，增加心肌收縮力〔11〕。本研究結果表明，枸櫞酸處理后血清Ca2+濃度顯著低于處理前，有一定時間規(guī)律，說明枸櫞酸螯合細胞外Ca2+作用較強。細胞外Ca2+經過Ca2+通道形成鈣電流，在慢反應細胞中參與自動除極，在快反應細胞參與形成超射。細胞凋亡在I/R損傷病理過程中發(fā)揮作用，細胞凋亡與氧自由基、細胞內鈣超載等多因素有關，凋亡觸發(fā)因素激活Caspase家族，引發(fā)瀑布級聯反應導致細胞凋亡，Caspase-3處于核心位置，心肌細胞凋亡與Caspase-3高表達區(qū)域在相同心肌缺血區(qū)域。本研究結果顯示，心肌I/R過程心肌細胞凋亡增加，枸櫞酸組Caspase-3蛋白表達下降，缺血早期主要為細胞凋亡，隨缺血程度增加發(fā)生心肌壞死，再灌注后由于細胞內鈣超載、大量自由基產生等促進不可逆性細胞凋亡，加重I/R損傷，枸櫞酸干預可通過抗凋亡作用保護心肌組織。

枸櫞酸干預可減輕心肌缺血后鈣內流導致的細胞內鈣超載，改善心肌電重構，心肌缺血缺氧抑制了心室肌細胞L-Ca-L，峰值電流下降，縮短肌細胞動作電位2相時程，心肌復極加速，導致各部位心室肌復極不統一，引發(fā)室性心律失常；L-Ca-L峰值電流降低一方面降低了Ca2+調節(jié)肌漿網作用，引發(fā)細胞內鈣超載形成震蕩性后電位，通過觸發(fā)活動引發(fā)室性心律失常，另一方面由于細胞內Ca2+水平升高激活細胞凋亡信號通路，促進凋亡基因表達，引發(fā)細胞凋亡，心肌梗死面積與心肌細胞凋亡程度有關，枸櫞酸對I/R大鼠心肌保護作用與降低血清Ca2+濃度，下調Capase-3蛋白、CAM表達水平，降低心肌細胞凋亡，減輕室性心律失常有關。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

李艷芳(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病的診斷和治療工作。

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A

1005-9202(2016)21-5249-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.015

1 長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院急診科