PI3K-AKT-mTOR信號通路在大鼠肺性腦病模型神經元自噬中的作用

曾凡軍 周媛媛 熊曉琦 阮玉姝 趙必君 萬曉蓉

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院，湖北 宜昌 443000)

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PI3K-AKT-mTOR信號通路在大鼠肺性腦病模型神經元自噬中的作用

曾凡軍 周媛媛 熊曉琦 阮玉姝 趙必君 萬曉蓉

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院，湖北 宜昌 443000)

目的 探討PI3K-AKT-mTOR信號通路在肺性腦病神經元自噬中的作用。方法 對36只新生健康SD大鼠乳鼠建立離體培養大鼠皮層神經元，隨機分為空白對照組、肺性腦病組、自噬抑制劑3-MA組后進一步建立了大鼠肺性腦病細胞模型，借助該模型運用CCK8法檢測神經元活力、MDC染色觀察神經元自噬泡數量、Western印跡法檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達。結果 與空白對照組比較，肺性腦病組神經元活力降低 (P<0.05)；神經元自噬泡數量增多；LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平增加(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，神經元活力降低更明顯、自噬泡數量明顯減少；缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、 Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平明顯降低。結論 缺氧和二氧化碳潴留的信號使Beclin-1表達增加、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化增加，加速PI3K磷酸化，使PI3K-AKT-mTOR信號通路失活，從而激活自噬信號通路，導致大腦神經元自噬增強。

肺性腦病；神經元自噬；PI3K-AKT-mTOR信號通路

肺性腦病是因呼吸衰竭導致低氧血癥和高碳酸血癥而出現神經精神癥狀的一種臨床綜合征，是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者嚴重的并發癥，病死率極高。大腦神經元自噬可能是其發病機制之一，PI3K-AKT-mTOR信號通路參與神經元自噬。本文探討神經元自噬與肺性腦病之間的相關性。

1 動物和方法

1.1 動物及分組 三峽大學醫學院實驗動物中心提供36只新生24 h內健康SD大鼠乳鼠。首先進行皮層神經元的培養及鑒定；培養5 d后進行缺氧實驗改良。隨機分為空白對照組、肺性腦病組、自噬抑制劑3-MA組。肺性腦病組神經元造模后取培養液上清，采用全自動生化分析儀器進行血氣分析。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠皮層神經元的培養 用75%酒精棉球擦拭乳鼠皮膚滅菌兩次，每次2 min，無菌環境下開顱分離雙側皮層，置預冷PBS 液中洗滌三遍去除血液，然后轉入安培瓶中，眼科剪剪碎。用含2%B27的Neurobasal培養基培養，之后每2天全量換液1次，取培養5 d的皮層神經元用于實驗。

1.2.2 乳鼠皮層神經元純度鑒定 細胞種板培養后第5天， 4%多聚甲醛進行預處理，MAP-2抗體標記皮層神經元胞質蛋白，Hochest33258進行細胞核染色。抗淬滅劑封片后，激光共聚焦顯微鏡下采集圖片。參照文獻進行大鼠皮層神經元純度鑒定〔1〕。

1.2.3 CCK8法檢測神經元活力 皮層神經元種植于96孔板，每組設6個復孔，施加處理因素后，于培養結束的最后4 h每孔加入20 μl CCK8溶液，每孔內總體積為200 μl，37℃繼續孵育6 h。酶標儀測定吸光度值。細胞存活率= (干預孔OD值-正常對照組OD 值均值)×100%。

1.2.4 MDC染色 棄去6孔板內的Neurobasal/B27培養基，PBS洗滌細胞兩次，加入2 ml含MDC的Neurobasal/B27(MDC終濃度為100 μmol/L)，置37℃培養箱中繼續培養1 h，棄培養基，PBS洗滌3次后每孔加入1 ml PBS，熒光顯微鏡下攝片。

1.2.5 Western印跡檢測自噬相關蛋白 使用自噬抑制劑3-MA預處理神經元，然后缺氧4 h，檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1及PI3K在各組神經元中的表達水平。對培養神經元不同時間段曝光圖片，選取合適圖片。Image-ProPlus 6.0軟件分析結果，目的條帶與GAPDH 條帶灰度比值為蛋白質相對含量。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析LSD法。

2 結 果

2.1 大鼠皮層神經元鑒定 大鼠皮層神經元種植培養2 d后，神經元胞體變大，呈梭形，突起進一步增多、延伸 (圖1A)；培養5 d后，神經元胞體圓潤豐滿，光暈明顯，突起相互交聯，形成神經網絡，突起細長多為2～4個 (圖1B)。激光共聚焦顯微鏡下，MAP-2/Cy3紅色熒光標記的神經元占總細胞數的90%以上，胞體和突起均被染色，胞體圓滿，突觸生長良好。

(A)瑞士-吉姆薩染色,倒置顯微鏡下圖像；(B)MAP-2/Hochest33258染色，激光共聚焦顯微鏡下圖像：經免疫熒光法染色后神經元胞體和突起呈紅色，細胞核呈藍色，箭頭示神經元圖1 培養5 d的大鼠皮層神經元

2.2 肺性腦病組神經元培養液血氣分析結果 培養液氧分壓為(10±2)mmHg，二氧化碳分壓為(70±20)mmHg，pH為(7.10±2.34)，與臨床肺性腦病患者血氣分析結果基本一致，表明肺性腦病造模成功。

2.3 三組神經元活力比較 與空白對照組比較，肺性腦病組神經元活力降低〔(85±10)% vs (98±8)%，P<0.05〕；與肺性腦病組比較，3-MA組神經元活力降低〔(21±69)%,P<0.05〕，提示缺氧及二氧化碳潴留可誘導神經元死亡；使用自噬抑制劑后，神經元死亡率增加，提示自噬是一種保護性反應。

2.4 三組神經元自噬泡MDC染色比較 與空白對照組比較，肺性腦病組神經元自噬泡數量增多(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，自噬泡數量明顯減少(P<0.05)，說明缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制。見圖2。

圖2 三組神經元MDC染色圖像和自噬泡數量(10 μm)

2.5 三組神經元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達比較 肺性腦病組中，Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加(P<0.05)。使用自噬抑制劑3-MA預處理后，缺氧誘導的自噬水平明顯受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值及 Beclin-1及磷酸化PI3K表達水平明顯降低。見圖3。

1～3:空白對照組、肺性腦病組、3-MA預處理組圖3 Western印跡檢測三組神經元LC3、Beclin-1及PI3K蛋白表達

3 討 論

目前較為普遍的觀點認為自噬通常促進細胞存活，可保護細胞在長時間的饑餓或者其他刺激狀況下存活〔2〕。缺氧及二氧化碳潴留可誘導神經元死亡，神經元活力降低；使用自噬抑制劑后，神經元死亡率增加，提示自噬是一種保護性反應。

MDC是一種綠色熒光染料，常用于自噬泡的示蹤劑，在熒光顯微鏡下可從形態學直觀觀察活細胞內自噬的變化〔3〕。本研究采用MDC染色發現：肺性腦病組神經元自噬泡數量增多，使用自噬抑制劑3-MA預處理后，缺氧及二氧化碳潴留誘導的神經元自噬水平明顯受到抑制。LC3蛋白有兩種存在形式，即LC3-I和LC3-Ⅱ〔4〕。自噬過程中，LC3-I與腦磷酯結合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/LC3-I比值與細胞自噬水平呈正比〔5〕。本研究表明神經元模擬肺性腦病條件下，神經元自噬增強，可以延緩或阻止神經元死亡。使用特異性自噬抑制劑后，神經元自噬減弱。Aita等〔6〕于1999年成功克隆了Beclin-1。Arsov等〔7〕發現Beclin-1廣泛表達于各組織的細胞質中。Beclin-1基因是介導其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關鍵基因，參與哺乳動物自噬體形成的調控〔8〕。Beclin-1表達增強可作為評價自噬水平升高的重要指標。同時Beclin-1是酵母Atg6的同源體，表達于反面高爾基網狀結構,與Ⅲ型PI3K和Atgl4L結合形成復合體,調控自噬前體產生和自噬體形成〔8〕。本研究發現，肺性腦病神經元模型中，Beclin-1表達升高，使用3-MA后，Beclin-1表達降低。PI3K磷酸化Ptdlns4P和Rdlns(4,5)PZ，生成PtdIns(3,4)PZ和PtdIns(3,4)兩種蛋白。這兩種蛋白結合AKT/PKB、PDK1，抑制自噬的發生，是自噬的負調節分子，PI3K為mTOR路徑的一部分〔2〕。PI3K-AKT-mTOR信號通路通過協調其下游蛋白的磷酸化，調節蛋白的合成、細胞周期的進展、細胞的代謝以及轉錄因子，從而控制細胞的生長、增殖、凋亡和自噬〔9〕。本研究發現在缺氧及高二氧化碳情況下，自噬發生依賴于PI3K磷酸化程度。

1 Gong Z,Yang LJ,Tang HM,etal.Protective effects of curcumin against human immunodeficiency virus 1 gp120 V3 loop-induced neuronal injury in rats〔J〕.Neural Regene Res,2012；7(3):171-5.

2 Yonekawa T,Thorburn A.Autophagy and cell death〔J〕.Essays Biochem,2013；55(1):105-17.

3 Balduini W,Carloni S,Buonocore G.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury〔J〕.J Matern Fetal Neonatal Med,2012；25(Suppl 1)：30-4.

4 Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,etal.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing〔J〕.EMBO J,2000；19(21):5720-8.

5 Karim MR,Kanazawa T,Daigaku Y,etal.Cytosolic LC3 ratio as a sensitive index of macroautophagy in isolated rat hepatocytes and H4-II-E cells〔J〕.Autophagy,2007；3(6):553-60.

6 Aita VM,Liang XH,Murty VV,etal.Cloning and genomic organization of beclin 1,a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21〔J〕.Genomics,1999；59(1):59-65.

7 Arsov I,Li X,Matthews G,etal.BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development〔J〕.Cell Death Differ,2008；15(9):1385-95.

8 Pattingre S,Espert L,Biard-Piechaczyk M,etal.Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes〔J〕.Biochimie,2008；90(2):313-23.

9 Shaw RJ,Cantley LC.Ras,PI (3) K and mTOR, signalling controls tumour cell growth〔J〕.Nature,2006；441(7092):424-30.

〔2015-06-23修回〕

(編輯 曹夢園)

曾凡軍(1968-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事呼吸系統疾病研究。

R747.9

A

1005-9202(2016)21-5247-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.014