慢性缺血致血管性認知障礙大鼠腦白質病變與Ephrin-B3的相關性

趙 騰 丁 穎 王 超 周春奎

(吉林大學第一醫院二部，吉林 長春 130031)

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慢性缺血致血管性認知障礙大鼠腦白質病變與Ephrin-B3的相關性

趙 騰 丁 穎 王 超 周春奎

(吉林大學第一醫院二部，吉林 長春 130031)

目的 探討Ephrin-B3是否參與了慢性腦缺血大鼠的腦白質損害及認知功能障礙。方法 選用 Wistar 大鼠48只，隨機分為假手術1組、假手術2組、模型30 d組、模型60 d組。模型組組應用大鼠雙側頸總動脈永久結扎法(2VO)制備慢性前腦缺血致血管性癡呆動物模型，假手術組僅有手術過程而未行雙側頸總動脈結扎。術后30 d，采用Morris水迷宮對假手術1組及模型30 d組大鼠于手術前及手術后的逃避潛伏期時間進行檢測，比較手術前后及各組間的差異。而后將2組大鼠斷頭取腦。部分行HE染色，部分腦組織制成勻漿，行ELISA 檢測，統量各組Ephrin-B3的表達。術后60 d，按照上述同樣的方法對假手術2組及模型2組大鼠進行處理。結果 造模后30 d，模型1組大鼠水迷宮的逃避潛伏期時間與假手術1組相比差異顯著(P<0.05)；造模后60 d，模型2組大鼠水迷宮的逃避潛伏期時間與假手術2組相比差異顯著(P<0.05)，說明模型組大鼠學習記憶能力均明顯降低。經HE染色，發現缺血30 d及60 d組大鼠胼胝質部位出現明顯白質疏松、細胞數量減少，并出現空泡樣改變。經ELISA檢測，假手術1組、模型30 d組、假手術2組、模型60 d組大鼠腦內Ephrin-B3濃度分別為(11.76±1.26)ng/ml、(12.08±1.32)ng/ml、(37.25±5.32)ng/ml、(48.65±6.88)ng/ml。模型30 d組與假手術1組Ephrin-B3表達量相比差異顯著(P<0.05)；模型2組與假手術2組相比差異顯著(P<0.05)。結論 Ephrin-B3可能參與了慢性缺血致血管性癡呆大鼠的腦白質損害及認知功能障礙。

血管性癡呆；腦白質病變；Ephrin-B3

血管性認知障礙(VCI)是指由腦血管疾病引起的腦損害所致的認知障礙，慢性腦缺血是最常見的原因之一。VCI患者認知損害的特征主要為執行功能損害，也可以表現為記憶力損害〔1〕。目前研究認為記憶力障礙主要與海馬功能損害有關，而執行功能障礙主要與皮層下白質損害有關〔2〕。腦白質病變是VCI的主要病理變化，包括髓鞘脫失、軸突變性及神經纖維斷裂。Ephrin-B3主要為少突膠質細胞表達的一種髓鞘生長相關抑制因子(MAIFs)，在髓鞘損傷后修復及抑制軸突再生的過程中起到關鍵作用。慢性腦缺血后腦白質出現的一系列病理變化可能伴隨著Ephrin-B3的表達變化。本研究探討Ephrin-B3是否參與了慢性缺血后VCI的發生。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雄性Wistar大鼠48只，250～300 g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供及喂養，實驗動物生產許可證：SCXK(吉)2014-0006，實驗動物使用許可證：SYXK(吉)2014-0018，實驗在吉林大學基礎實驗室進行。

1.2 實驗動物分組及模型制備 48只Wistar大鼠在分組前都要進行Morris 水迷宮實驗篩選，統計大鼠的訓練成績，淘汰游泳能力差或智力低下的大鼠。按隨機數字表法分為缺血模型組和假手術組，每組24只。缺血模型組在手術后又分為 30 d、60 d亞組，每組12 只(6只用于HE染色；6只用于ELISA)。術后死亡的大鼠被剔除，并隨時補足相應數目的動物。大鼠稱重，10%水合氯醛300 mg采用雙側頸總動脈永久結扎方法(2OV)制備慢性腦缺血動物模型。

1.3 水迷宮檢測及樣本制備 造模后30 d，對各組大鼠進行水迷宮試驗，4次/d，2 min/次，共5 d，記錄其逃避潛伏期。而后對假手術組隨機抽取12只及12只30 d缺血模型組大鼠用 10%水合氯醛麻醉，之后在冰盤上快速斷頭取腦。各組隨機抽取6只，用4%多聚甲醛后固定16 h，30%蔗糖溶液浸泡至標本下沉，錫箔紙包裹，-70℃冰箱保存，-20℃恒冷切片機上連續冠狀切片，片厚20 μm，制成冰凍切片。采用石蠟包埋的方法制備石蠟切片。各組剩余6只將取出腦組織置于玻璃勻漿器中研磨，2 000 r/min離心15 min，留取上清。無菌條件下過濾，-80℃保存備用。造模后60 d，按照同樣方法將假手術組剩余12只及60 d 缺血模型組大鼠斷頭取腦，進行蘇木素-伊紅(HE)染色及提取腦勻漿上清。

1.4 Ephrin-B3的檢測方法 標準品按以下濃度備比稀釋48、24、12、6、3、1.5 ng/ml。大鼠Ephrin-B3抗體，產地：上海，規格1.0 g。設定空白孔、標準品孔及樣品孔。將稀釋后的不同濃度標準品加入標準品孔中，在樣本孔內先加入10 μl待測樣本，然后用稀釋液稀釋5倍，空白孔不加。在各樣本孔和標準品中每孔均加入100 μl辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體，封板膜密封，37℃水浴60 min。棄去液體后拍干，加洗滌液300 μl/孔，靜置1 min后拍干，如此重復5次，然后拍干。分別加入底物A和底物B 50 μl/孔，37℃避光孵育15 min。取出酶標板，加終止液終止反應50 μl/孔。以空白孔調零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。終止后15 min內檢測完成，以標準品的濃度和OD值作標準曲線，然后根據樣品的OD值和標準曲線所對應的公式計算出Ephrin-B3的濃度值即可。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計學分析軟件對數據的組間比較進行方差分析。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮結果 見表1，表2。

2.2 胼胝體HE染色 在假手術組大鼠的胼胝體并未發現白質疏松，細胞沿軸突較規則地排列，纖維排列相對整齊。而在缺血模型組大鼠胼胝體中可觀察到不同程度的腦白質疏松，纖維排列凌亂，細胞數量減少，可見空泡樣改變，隨著缺血時間的延長，上述改變逐漸加重。見圖1。

表1 造模前水迷宮逃避潛伏期時間比較

表2 造模后水迷宮逃避潛伏期時間比較

圖1 各組大鼠胼胝體HE染色(×40)

2.3 Ephrin-B3檢測結果 Ephrin-B3水平假手術1組為(11.76±1.26)ng/ml；假手術2組為(12.08±1.32)ng/ml；30 d組為(37.25±5.32)ng/ml；60 d組為(48.65±6.88)ng/ml。30 d組及60 d組分別與假手術組相比，差異顯著(t=6.125、7.286，P<0.05)；而60 d組與30 d組相比也有顯著差異(t=1.89，P<0.05)。

3 討 論

執行功能障礙突出被認為是VCI區別于其他類型認知障礙的特點之一，而執行功能障礙主要與皮層和皮層下結構聯系功能障礙有關〔2〕，因此認為，皮層下白質損害與VCI關系密切。

有研究顯示慢性缺血是導致VCI的常見原因之一，慢性腦缺血的組織病理學改變包括皮質及海馬萎縮及神經元變性、腦白質疏松、膠質細胞增生和毛細血管床減少等〔3〕。而腦白質疏松的主要表現是少突膠質細胞凋亡導致的髓鞘脫失以及軸突變性，從而導致神經纖維脫失。既往大量研究顯示通過促進少突膠質細胞存活可以使損傷或脫失的髓鞘得到修復，而軸突一旦損傷后其修復及再生則非常困難。其原因并非軸突不可再生，而是由軸突周圍的少突膠質細胞形成的髓鞘內存在抑制軸突再生的眾多因子，即MAIFs，主要包括Nogo蛋白、OMgP蛋白、MAG蛋白及后期發現的Ephrin蛋白，其中Ephrin-B3被認為是作用更為明顯的軸突生長抑制因子〔4，5〕。Ephrin-B3是促紅細胞生成素誘導的肝細胞受體(Eph)家族成員之一，在正常生理狀況下處于低表達水平，但當出現神經損傷時，在相應突觸及少突膠質細胞中即可大量表達，其主要功能為維護髓鞘的完整及抑制軸突的再生。目前Ephrin-B3與脊髓損傷后的修復的相關性研究較為集中〔6〕，其與VCI的相關性研究國內外尚未見報道。但從VCI的病理學變化來看，Ephrin-B3可能通對缺血后損傷的白質內軸突的再生產生抑制，從而加重認知功能的損害。本研究結果證明Ephrin-B3參與了慢性缺血所致的腦白質損傷，進而引起認知功能障礙。

1 Lopez-Valdes HE，Clarkson AN，Ao Y，etal.Memantine enhances recovery from stroke〔J〕.Stroke，2014；45(7)：2093-100.

2 Bird CM，Burgess N.The hippocampus and memory：insights from spatial processing〔J〕.Nat Rev Neurosci，2008；9(3)：182-94.

3 Lee JH，Parka SY，Shin YW，etal.Concurrent administration of cilostazol with donepezil effectively improves cognitive dysfunction with increased neuroprotection after chronic cerebral hypoperfusion in rats〔J〕.Brainres，2007；1185(4)：246-155.

4 Harvey PA，Lee DH，Qian F，etal.Blockade of Nogo receptor ligands promotes functional regeneration of sensory axons after dorsal root crush〔J〕.J Neurosci，2009；29(19)：6285-95.

5 Benson MD，Romero MI，Lush ME，etal.Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2005；102(30)：10694-9.

6 Qu Y，Zhao J，Wang Y，etal.Silencing ephrinB3 improves functional recovery following spinal cord injury〔J〕.Mol Med Rep，2014；9(5)：1761-6.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林大學第一醫院二部專項基金(A03)

周春奎(1962-)，男，教授，碩士生導師，主要從事腦血管病與癡呆的研究

趙 騰(1985-)，男，主治醫師，主要從事腦血管病與癡呆的研究。

R743

A

1005-9202(2016)21-5245-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.013