五味子水提物對反復(fù)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦能量代謝的影響

馬素好 李鳳麗 張家梁

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064)

?

五味子水提物對反復(fù)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦能量代謝的影響

馬素好 李鳳麗 張家梁

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450064)

目的 探討五味子水提物對反復(fù)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦能量代謝的影響。方法 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、尼莫地平組、五味子水堤物大、中、小劑量組，后四組分別灌服尼莫地平混懸液、五味子水提物大、中、小劑量。空白組和模型組給予同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥10 d，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉，建立反復(fù)腦缺血再灌注模型。術(shù)后24 h用避暗法進(jìn)行行為學(xué)檢測，觀察并記錄小鼠首次進(jìn)入暗室的潛伏期及5 min內(nèi)進(jìn)入暗室遭電擊的次數(shù)。行為學(xué)檢測完畢小鼠斷頭取腦，測乳酸(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)、乙酰膽堿酯酶(AchE)活力以及ATP酶活力。結(jié)果 與模型組相比，尼莫地平組可以顯著增加小鼠的潛伏期、顯著降低小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)發(fā)生的次數(shù)(均P<0.01)，五味子水提物大劑量組可以明顯增加小鼠潛伏期并顯著降低小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)發(fā)生的次數(shù)(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，尼莫地平組、五味子水提物中、小劑量組均可顯著減少小鼠LD的含量(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大、中劑量組均可以顯著升高小鼠LDH的活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物組小劑量均可顯著升高小鼠AchE活力(P<0.01)；與模型組相比，尼莫地平組、五味子水提物大劑量組可以顯著升高小鼠Na+-K+-ATP酶活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大、中劑量組均能顯著升高小鼠Ca2+-ATP酶活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大劑量組能夠顯著升高小鼠Ca2+-Mg2+-ATP酶活力(P<0.01)。結(jié)論 五味子水提物可以改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力并提高腦組織功能。

五味子水提物；反復(fù)腦缺血再灌注；學(xué)習(xí)記憶；腦能量代謝

對于腦血管疾病的治療，目前西醫(yī)僅以改善腦部血循環(huán)、擴(kuò)血管增加缺血區(qū)血流量、消除腦水腫、降低血液黏滯性、防止血栓延續(xù)等對癥治療為主〔1〕，但大多西藥都伴隨著嚴(yán)重不良反應(yīng)，制約了藥物療效的發(fā)揮和疾病的康復(fù)。中藥在對抗腦缺血發(fā)作方面有著自己的優(yōu)勢。五味子性酸、甘、溫，具有收斂、固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效。前期人們重在對五味子的藥理藥性方面的研究。近年來，有人對五味子藥理活性也進(jìn)行了研究〔2〕，本實(shí)驗(yàn)研究五味子水提物對反復(fù)腦缺血再灌注致記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶以及能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，體重19～22 g，雌雄各半，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號:1011023。

1.2 試劑 五味子為木蘭科植物五味子(Turcz)的干燥成熟果實(shí),又稱北五味子〔3〕，該藥購自河南皖西制藥有限公司，并經(jīng)專家鑒定為正品。五味子100 g，經(jīng)水煎煮兩次，合并兩次濾液，濃縮至200 ml(1 ml含生藥0.5 g)。尼莫地平片，生產(chǎn)廠家：天津市中央藥業(yè)有限公司，規(guī)格30 mg/片，批號0903108。小鼠條件反射箱，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。乙酰膽堿酯酶(AChE)測試盒，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號20111012；乳酸脫氫酶(LDH)測試盒,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號20110911；乳酸(LD)測試盒,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號20111009；ATP酶測試盒,上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號20111101。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將72只昆明種小鼠隨機(jī)分成6組(雌雄分籠飼養(yǎng))，分別為：空白組、模型組、尼莫地平組、五味子水提物大、中、小劑量組。除空白組和模型組外，給尼莫地平組小鼠灌服尼莫地平混懸液(0.01 g/kg、0.2 ml/10 g)，給五味子各組分別灌服五味子水提物大、中、小劑量(0.6 g/kg、0.3 g/kg、0.15 g/kg、0.2 ml/10 g)?？瞻捉M和模型組給予同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥10 d，進(jìn)行手術(shù)。用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，將上述小鼠仰位固定在鼠板上，行頸部切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。然后用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷血流，10 min之后，松開動(dòng)脈夾，使血液再灌注10 min，反復(fù)進(jìn)行2次。手術(shù)之后的創(chuàng)口應(yīng)以碘伏消毒，最后縫合傷口。術(shù)后24 h，上述各組小鼠均進(jìn)行行為學(xué)測定(避暗法)〔4〕，將小鼠頭部背向洞口放入明室，然后通以25 V的電壓，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，小鼠一進(jìn)入立即受到電擊，而計(jì)時(shí)器則同時(shí)停止計(jì)時(shí)。取出小鼠，記錄每鼠從放入明室至進(jìn)入暗室遇到電擊所需的時(shí)間，此即潛伏期。24 h后重新測驗(yàn)，記錄潛伏期和5 min內(nèi)的電擊次數(shù)。將完成行為學(xué)測定的小鼠斷頭取腦，其中一半稱重，加9倍的生理鹽水制成10%的腦勻漿，以備測LD、LDH、AchE活力以及ATP酶活力，上述測定方法均按各自的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 五味子水提物對小鼠行為學(xué)的影響(避暗法) 與空白組相比，模型組可顯著降低小鼠的潛伏期、顯著升高小鼠的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)(均P<0.01)，說明該實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比，尼莫地平組可以顯著增加小鼠的潛伏期、顯著降低小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)發(fā)生的次數(shù)(均P<0.01)，五味子水提物大劑量組可以明顯增加小鼠潛伏期，顯著降低小鼠錯(cuò)誤反應(yīng)發(fā)生的次數(shù)(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2 五味子水提物對小鼠腦組織中LD、LDH及AChE活力的影響 與空白組相比，模型組能夠顯著提高小鼠LD的含量、顯著減少小鼠LDH及AchE的活力(P<0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比，尼莫地平組、五味子水提物中、小劑量組均可顯著減少小鼠LD的含量(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大、中劑量組均可以顯著升高小鼠LDH的活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物組小劑量均可顯著升高小鼠AchE的活力(P<0.01)。見表2。

2.3 五味子水提物對小鼠腦組織中ATP酶活力的影響 與空白組相比，模型組能夠顯著減少小鼠ATP酶的活力(P<0.01)，說明本實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比，尼莫地平組、五味子水提物大劑量組可以顯著升高小鼠Na+-K+-ATP酶的活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大、中劑量組均能顯著升高小鼠Ca2+-ATP酶的活力(P<0.01)，尼莫地平組、五味子水提物大劑量組能夠顯著升高小鼠Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力(P<0.01)。見表2。

表1 五味子水提物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

與模型組比較：1)P<0.01；2)P<0.05，下表同

表2 五味子水提物對小鼠腦組織中LD、LDH及AChE及ATP酶活力的影響±s,n=12)

3 討 論

然而由于腦缺血引起的智力發(fā)育障礙，嚴(yán)重地影響著人們的學(xué)習(xí)、工作和生活，給患者造成了很大的精神壓力〔5〕。目前，對于缺血性腦血管病研究的最大困難是缺少與臨床接近的動(dòng)物模型?，F(xiàn)有的應(yīng)用較廣泛的、常用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭饕醒荛]塞法以及局限性大腦中動(dòng)脈缺血等模型〔6〕，但是上述模型有自身的缺陷和不足，原因如下：①動(dòng)物麻醉復(fù)雜，在這些實(shí)驗(yàn)中人們大多采用戊巴比妥鈉類麻醉劑，但是該制劑麻醉效果值得商榷。②實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，造模時(shí)間長，比較復(fù)雜，需要耗時(shí)2～3 d才能完成造模，且造模手術(shù)難度高，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有創(chuàng)傷性，影響人們對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。本實(shí)驗(yàn)采用的造模方法與上述方法相比，有自身的優(yōu)勢，方法簡單、可操作，采用在解剖學(xué)上與人比較接近的小鼠作為研究對象，實(shí)驗(yàn)過程中，在動(dòng)物的死亡率上得到了控制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠，為臨床治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)提示五味子具有改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的功能。研究表明〔7，8〕，腦神經(jīng)功能與腦部的能量代謝密不可分，一旦腦部出現(xiàn)局部的缺血障礙，就會(huì)導(dǎo)致腦部出現(xiàn)缺血缺氧現(xiàn)象。如果腦內(nèi)血流被阻斷，5 s內(nèi)腦神經(jīng)元的代謝就會(huì)受到影響，1～2 min腦部電活動(dòng)就會(huì)停止，6 min開始腦的能量代謝以及電解質(zhì)平衡將會(huì)被打破，致使腦內(nèi)ATP被大量的耗竭，細(xì)胞膜的離子泵功能出現(xiàn)障礙，K+外流、Na+、Cl-和水大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，如果這種現(xiàn)象持續(xù)6～15 min腦神經(jīng)元就會(huì)發(fā)生不可逆的損害。由此，我們可以知道，腦部的能量代謝可以直接反映腦的神經(jīng)功能，在采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致腦缺血模型的研究中發(fā)現(xiàn)，大腦的嚴(yán)重缺血會(huì)導(dǎo)致LD升高，LDH以及AChE活力降低，細(xì)胞膜的Na+- K+-ATP酶〔9〕活性也隨之降低，出現(xiàn)ATP耗竭現(xiàn)象，致使腦細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重障礙，嚴(yán)重?fù)p傷腦的功能。本結(jié)果提示五味子具有改善小鼠腦能量代謝的作用。

我國歷代均有五味子養(yǎng)五臟、除熱，補(bǔ)虛勞，令人悅澤，明目等記載，提示五味子有很好的抗老化作用〔10〕。本研究結(jié)果提示，五味子水提物具有一定改善學(xué)習(xí)記憶的功能并能夠改善小鼠腦部的能量代謝。

1 吳蠡蓀.腦血管血栓病臨床治療進(jìn)展〔J〕.微循環(huán)學(xué)雜志，2012；22(2):72-6.

2 陸兔林，吳 揚(yáng)，季 德，等.五味子多糖提取分離和藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國中藥雜志，2014；39(4)：751-4.

3 史 琳,王志成,馮敘橋.五味子化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.藥物評價(jià)研究，2011；34(3):208-10.

4 張洪江,張紅英,王 玉.馬齒莧正丁醇提取物對 D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶作用的研究〔J〕.食品科學(xué),2011；32(3):205-7.

5 苗明三,張廣偉,馬 霄.五味子醇提部位對反復(fù)腦缺血再灌注致記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響〔J〕.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2009；26(5):353-6.

6 嚴(yán)春臨,張 季,高艷青,等.吳茱萸次堿對腦缺血再灌注小鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制研究〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013；19(6):264-6.

7 張現(xiàn)濤,梁 軍,劉紅霞,等.銀杏葉內(nèi)酯N對實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012；18(1):141-2.

8 周凌云，羅亞非，曹永芬，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對局灶性腦缺血再灌注損傷后大鼠行為及海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012；22(35):26-31.

9 趙 儉,韓冰冰,高 娜,等.附子對虛寒模型大鼠肝組織糖原、LD含量、LDH活力及肝SDH、ATP酶活力的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志,2011；38(7):1455-6.

10 劉 威,張 茜,張成義.五味子對心血管系統(tǒng)作用的研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011；12(1):47-9.

〔2015-07-18修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(No.121PCXTD520)

馬素好(1969-)，女，在職碩士，主治醫(yī)師，主要從事心腦血管內(nèi)科研究。

R285

A

1005-9202(2016)21-5243-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.012