骨髓間充質干細胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影響

范 雪 王愛娟 張 云 李 楠 于 洋 艾 浩

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產科，遼寧 錦州 121001)

?

骨髓間充質干細胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢功能的影響

范 雪 王愛娟 張 云1李 楠 于 洋2艾 浩

(錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討骨髓間充質干細胞對卵巢早衰模型小鼠的影響。方法 取ICR小鼠骨髓間充質干細胞用于細胞移植。健康ICR小鼠60只隨機分為對照組、模型組、治療組。對照組小鼠不進行任何干預，模型組和治療組小鼠腹腔注射順鉑建立化療性損傷小鼠卵巢早衰動物模型。治療組造模后一次性原位注射骨髓間充質干細胞進行治療。觀察大鼠一般情況、動情周期，并測定血清中E2、FSH含量以及卵巢組織形態(tài)改變。結果 模型組小鼠動情周期紊亂，經過干細胞治療后的小鼠動情周期基本恢復正常。與對照組比較，模型組E2下降，FSH水平升高(P<0.05)。經骨髓間充質干細胞治療后E2上升，FSH水平下降，幾近恢復正常水平。模型組濾泡大部分受到破壞，濾泡數量明顯少于對照組(P<0.01)。骨髓間充質干細胞治療后濾泡及黃體數目均明顯增加(包括新形成的黃體)，與模型組比較差異顯著(P<0.01)。結論 順鉑可致卵泡顆粒細胞凋亡，造成卵巢功能過早衰退，骨髓間充質干細胞通過調節(jié)血清中各激素含量，可降低順鉑對卵巢的損害，促進卵泡發(fā)育，改善并增強卵巢功能。

卵巢早衰；骨髓間充質干細胞；順鉑

卵巢早衰(POF)是由多種病因導致的卵泡功能衰竭。POF治療棘手,近年國內外取得了應用干細胞恢復卵巢功能及生育力等方面的動物試驗成果，為POF患者卵巢功能及生育功能的恢復帶來了希望〔1〕。目前成體干細胞治療包括生殖干細胞、骨髓間充質干細胞(BMSCs)和胎兒間充質干細胞的治療，因其取材方便且不涉及倫理學標準而在實驗中得到廣泛應用〔2〕。有研究顯示，干細胞移植治療POF，可改變卵巢組織形態(tài)，使卵巢彈性和韌性得到一定程度上的恢復，而干細胞分泌的一些因子可改善卵泡數量和質量以及減少卵巢內凋亡細胞的作用，并借此有效改善了卵巢功能〔3,4〕。本研究擬為POF的臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 健康ICR小鼠62只，清潔級，雌性，體質量28～30 g，由錦州醫(yī)科大學動物實驗室提供。注射用順鉑(CDDP，10 mg/支)，齊魯制藥公司生產。ELISA試劑盒均購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、純化培養(yǎng)與鑒定 取2只ICR小鼠，脫臼法處死后無菌條件下取其股骨和脛骨，沖出骨髓，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液將骨髓制成單細胞懸液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過貼壁篩選法篩選出純度較高的骨髓間充質干細胞。原代培養(yǎng)5～7 d后，收集bMSCs，加入抗體，按照PE/FITC標記，CD34/44/45/105的流式細胞鑒定，證明其為bMSCs〔4〕。取第3代bMSCs，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后重懸細胞，細胞濃度調整為1×106/ml的細胞懸液，用于細胞移植注射。

1.2.2 POF模型小鼠的建立及分組 將60只ICR小鼠隨機均分為三組(n=20)，對照組不做任何處理，模型組和干細胞治療組小鼠腹腔注射順鉑6 mg/kg生理鹽水配比制備小鼠早衰模型〔5〕，每天同一時間注射1次，連續(xù)注射14 d。造模期間每天進行陰道涂片，觀察動情周期的變化，以確定造模成功。造模后模型組小鼠不進行任何干預。干細胞治療組小鼠造模后用0.2%戊巴比妥鈉0.1 ml麻醉，背面朝上，鈍性分離筋膜，可見腎臟上方的白色脂肪墊，拖出脂肪墊找出兩側卵巢，將卵巢固定，每側緩慢注射BMSCs 20 μl，同時注意止血，關腹后給予青霉素10萬U預防感染。細胞移植后1 w檢測損傷卵巢的修復情況。

1.3 觀察指標

1.3.1 陰道涂片及血中激素測定 每天早、晚8：00各一次取小鼠陰道脫落細胞涂片，于光學顯微鏡下觀察其性周期，根據脫落細胞類型按標準分析動情周期，以動情期或動情間期占總觀察時間的百分比為其構成比〔6〕。在造模2 w后取各組小鼠眶靜脈血，ELISA法測定血清卵泡激素(FSH)和雌二醇(E2)，嚴格按照說明書操作。

1.3.2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學觀察 頸椎脫位法處死小鼠，同時取卵巢待測。收集的卵巢經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察卵巢組織及卵泡的形態(tài)，同時在光學顯微鏡下計數黃體及各個時期濾泡數量，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.5軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 陰道脫落細胞涂片 模型組小鼠動情期〔(9.4±5.2)%〕顯著降低，動情間期〔(42.5±17.2)%〕延長，出現動情周期紊亂；而治療組小鼠動情周期〔(18.9±8.7)%〕和動情間期〔(25.7±4.7)%〕與對照組〔(20.7±9.2)%、(24.0±3.5)%〕比較無顯著差異(P>0.05)；治療組與模型組比較，動情周期紊亂顯著降低(P<0.05)。

2.2 各組FSH和E2含量比較 與對照組E2〔(185.25±30.30)pmol/L〕、FSH〔(0.95±0.50)pmol/L〕比較，模型組E2含量〔(127.35±22.98)pmol/L〕顯著下降，而FSH含量〔(1.91±0.63)pmol/L〕顯著增加(P<0.05)，治療組E2含量〔(170.32±29.27)pmol/L〕比模型組顯著升高(P<0.05)，而FSH水平〔(1.05±0.29)pmol/L〕顯著降低，接近正常水平。

2.3 各組小鼠卵巢組織炎形態(tài)學分析 對照組小鼠卵巢體積較大，卵泡生長活躍，排列整齊，黃體細胞豐富，清晰可見。模型組卵泡數量明顯較少，排列紊亂，形態(tài)不一，黃體數目明顯減少。治療組可見卵泡數目和黃體數量均增多，形態(tài)和數目均好于模型組，層次清晰，僅次于對照組形態(tài)。見表1，圖1。

表1 各組小鼠卵巢濾泡及黃體計數比較(個，

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學觀察(HE，×200)

3 討 論

POF由多種原因引起，但最常見的原因是自體免疫功能異常，病理改變是卵泡靜止、數量減少甚至消失，代之以結締組織增生。目前臨床上常以激素替代治療為主〔7〕，但治療效果具有一定局限性，且容易導致癌癥發(fā)生。

干細胞是人體一類具有自我更新、多向分化潛能的細胞，不僅有組織細胞的再生修復作用，還有強大的免疫調節(jié)功能，給POF帶來了全新的細胞再生治療模式〔8〕。研究顯示，干細胞可以通過血液循環(huán)遷徙到患者卵巢，在早衰卵巢內逐漸分化為卵巢細胞，并發(fā)揮卵巢功能，分泌雌激素。干細胞治療可有效遏制卵巢進一步早衰，保護卵巢，重塑卵巢結構〔9〕，恢復卵巢功能，有效改善患者癥狀，對因缺乏雌激素而引起的骨質疏松也有很好的治療作用。

BMSCs來源廣、獲取容易、擴展能力強、免疫原性低、能歸巢、無醫(yī)學倫理爭議等優(yōu)點，成為再生醫(yī)學、干細胞療法中主要選擇細胞之一。同種異體細胞移植實際上是一種最強烈的免疫治療，可降低受體的供體細胞排斥反應和降低產品潛在的同種異體反應〔10〕。本研究中模型組小鼠表現為性周期紊亂，性周期延長至7～10 d，提示這些小鼠卵巢內卵泡較正常卵泡發(fā)育緩慢。有的小鼠持續(xù)停留在動情期，而不出現動情后期的表現，這可能與小鼠POF而引起卵泡不能發(fā)育成熟或不能排卵、無黃體生成有一定相關性〔11〕。BMSCs治療組小鼠動情周期基本回復正常，說明BMSCs有較好療效。

本實驗研究顯示，BMSCs移植至早衰小鼠卵巢后可能參與調整血液激素水平，使卵泡和黃體數量增加。另外，干細胞再生的卵巢細胞也可以對腦垂體分泌的相關激素作出及時、正確的反應，使體內激素水平處于平衡狀態(tài)。

1 呂曉琳,艾 浩.二仙湯對卵巢早衰免疫指標影響的臨床觀察〔J〕.中國婦幼保健,2016;31(9):1811-3.

2 郭 路,李 斌.干細胞應用于卵巢早衰的實驗研究進展〔J〕.老年醫(yī)學與保健,2015;21(6):422-5.

3 房麗紅.FOXO3 a基因聯(lián)合干細胞修復化療對卵巢早衰的作用及分子機制〔J〕.遼寧醫(yī)學雜志,2015;29(5):278-9.

4 Kon E,Fiardo G,Roffi A,etal.Bone regeneration with mesenchymal stem cells〔J〕.Clin Cases Miner Bone Metab,2012;9(1):24-7.

5 艾 浩,張海英,張玉立,等.二仙湯對順鉑損傷后小鼠卵巢功能調節(jié)作用研究〔J〕.天津中醫(yī)藥,2013;30(5):298-300.

6 Kikuehi-Taura A,Taguchi A,Kanda T,etal.Human umbilical cord provides a significant source of unexpanded mesenchymal stromal cells〔J〕.Cytotherapy,2012;14(4):441-50.

7 劉 雪,佳那提·秋瓦西,李朝曦,等.干細胞治療卵巢早衰的進展〔J〕.醫(yī)學綜述,2015;21(12):2151-3.

8 Qin Y,Vujovic S,Li G,etal.Ethnic specificity of variants of the ESR1,HK3,BRSK1 genes and the 8q22.3 locus:no association with premature ovarian failure(POF)in Serbian women〔J〕.Maturitas,2014;77(1):64-7.

9 Chen Y,Qian H,Zhu W,etal.Hepatocyte growth factor modification promotes the amelioration effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell on rat acute kidney injury〔J〕.Stem Cells Dev,2011;20(1):103-13.

10 Yong KW,Wan Safwani WK,Xu F,etal.Cryopreservation of human mesenchymal stem cells for clinical applications:current methods and challenges〔J〕.Biopreserv Biobank,2015;13(4):231-9.

11 Kilic S,Pinarli F,Ozogul C,etal.Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrow derived mesenchymal stem cells during puberty 〔J〕.Gynecol Endocrinol,2014;30(2):135-40.

〔2015-11-12修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金(No.81173443)；遼寧省科學計劃項目(No.2010042)

艾 浩(1974-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事卵巢早衰研究。

范 雪(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦產科疾病的診斷與治療研究。

R71

A

1005-9202(2016)21-5222-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.003

1 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)婦產科

2 錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院超聲科