液相色譜-質譜法測定茜草中蘆西丁含量

浦益瓊，丁越，王冰，張若曦，張彤

上海中醫藥大學，上海 201203

液相色譜-質譜法測定茜草中蘆西丁含量

浦益瓊，丁越，王冰，張若曦，張彤

上海中醫藥大學，上海 201203

目的運用液相色譜-質譜法測定茜草藥材中蘆西丁的含量。方法采用Agilent 1290HPLC-G6460三重四級桿質譜儀，在ESI-離子模式下選擇離子監測，色譜分離采用Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-乙腈（70∶30）為流動相，柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，進樣量2 μL。結果蘆西丁在0.005 2～2.64 ng范圍內呈良好線性關系（r＝0.999 9），80%、100%、120%濃度水平的加樣回收率為94.80%～100.94%（平均97.17%，RSD＝6.16%），方法重復性及精密度均良好。結論本研究建立的方法靈敏、準確，重復性好，適用于茜草中蘆西丁的含量測定，可用于茜草藥材中該成分的限度檢查。

茜草；蘆西丁；液相色譜-質譜聯用

茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根及根莖，主產于我國東北、華北、西北和四川及西藏等地，春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。其性寒，味苦，歸肝經，常用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經閉、關節痹痛、跌仆腫痛。茜草的主要成分為蒽醌及其苷類化合物，還含有萘醌類、萜類、己肽類、多糖類等其他化學成分，其藥理作用主要包括止血、抗血小板聚集、升白細胞、鎮咳祛痰、抗菌、抗癌等。據文獻報道，茜草科Rubiaceae茜草屬Rubia植物廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲和南美洲的熱帶及溫帶地區，全球約有70種，我國有其中的12種以上[1]。其中，除了被現行《中華人民共和國藥典》收錄的茜草Rubia cordifolia L.外，另一品種歐茜草R. tinctorum L.亦在我國可見[2]，分布于新疆及喜馬拉雅地區，在國內被稱為新疆茜草，以根作為茜草收購使用。在現代醫藥應用中，歐茜草常被作為通便劑或一種溫和的鎮靜劑，用于治療腎結石和膀胱結石，以及月經不調或泌尿系統紊亂等癥[3-7]，是用于治療腎結石的藥物“消石素”（德國產）處方中的主藥，但由于歐茜草中含有蘆西丁，有較強的致基因突變、細胞轉化及DNA結合作用，因此美國FDA已明確將其列為禁用藥物。

目前，針對茜草中相關有害成分的研究報道較少，2015年版《中華人民共和國藥典》一部“茜草”項下的含量測定中只規定了大葉茜草素和羥基茜草素的含量測定方法，未涉及其他物質的定量分析內容。本研究采用液相色譜-質譜法（LC-MS），以蘆西丁作為指標成分，對茜草Rubia cordifolia L.進行測定，探索完善該藥材的質量標準，提高用藥安全性和有效性，提高茜草制劑的質量。

1　儀器與試藥

Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent公司；G6460三重四級桿質譜儀，Agilent公司；Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），Agilent公司；SK5200H高頻超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；FA1004N電子天平，上海精宏科學儀器有限公司。

蘆西丁對照品（純度≥98%），德國Phytolab公司；色譜純乙腈，Merck公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。15批茜草飲片均購于飲片公司，產地分別為陜西、安徽、山西、河南，經上海中醫藥大學教學實驗中心中藥鑒定實驗室鑒定為茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖。

2　方法與結果

2.1色譜條件與系統適用性

2.1.1液相色譜條件Agilent Eclipse Plus C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸-乙腈（70∶30），柱溫30 ℃，流速0.4 mL/min，進樣量2 μL。

2.1.2質譜條件離子源：ESI；MS1/MS2加熱器溫度：100 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：10.0 L/min；霧化氣壓力：40.0 psi；毛細管電壓：3500 V；監測離子通道：251.1/223.3；駐留時間：200 ms；Fragmentor電壓：90 V；碰撞能量：15 V；極性：Negative。

2.1.3系統適用性試驗在上述檢測條件下，蘆西丁對照品及茜草飲片供試品溶液多反應監測色譜圖見圖1、圖2。

2.2線性關系考察

取濃度為1.32 μg/mL的蘆西丁對照品溶液作為母液，依次適當倍數稀釋，得到0.002 6～1.32 μg/mL一系列對照品溶液，按“2.1”項下檢測條件，測定MS的響應值（子離子峰面積），結果顯示，以碎片離子峰（m/z＝251.1）積分面積為縱坐標，蘆西丁對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝33 236X＋64.344，r＝0.999 9。結果表明，蘆西丁在0.005 2～2.64 ng范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3精密度試驗

取不同濃度的蘆西丁對照品溶液3份，其濃度分別為0.165、0.020 63、0.002 58 μg/mL，按“2.1”項下檢測條件進行測定，分別連續測定5次，記錄所得子離子峰的峰面積。結果顯示，該3個濃度樣品的峰面積分別為5315.4、678.4、80.8，RSD分別為3.06%、4.45%、4.83%，精密度良好。

圖1　蘆西丁對照品LC-MS圖

圖2　茜草飲片供試品LC-MS圖

2.4供試品溶液的溶劑選擇

分別取茜草飲片粉末（批號110903，過四號篩）約0.2 g，平行6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入80%乙醇10 mL（3份）和甲醇溶液10 mL（3份），密塞，稱定質量，放置過夜后，超聲處理（頻率53 kHz，功率200 W）30 min，放冷，再稱定質量，用80%乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

按“2.1”項下檢測條件進行測定，用外標法將所得響應值與對照品對照，計算藥材粉末中蘆西丁的含量。結果顯示，以80%乙醇、甲醇為提取溶劑制備的樣品中蘆西丁含量分別為0.004 06%、0.004 60%，RSD分別為2.85%、4.62%，因此選擇甲醇作為超聲溶劑。

2.5重復性試驗

取茜草飲片粉末（批號110903）約0.2 g，精密稱定，以甲醇為溶劑，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下檢測條件進行測定，平行5份，用外標法將所得響應值與對照品對照，計算藥材粉末中蘆西丁的含量。結果顯示，該5份樣品的蘆西丁平均含量為0.004 52%，RSD＝4.18%，表明本方法重復性良好。

2.6加樣回收率試驗

取茜草飲片粉末（批號110903）約0.1 g，共9份，精密稱定，每份樣品粉末中加入蘆西丁對照品適量，再按“2.4”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下檢測條件進行測定，用外標法將所得響應值與對照品對照，分別計算加樣回收率。結果見表1。

表1　茜草中蘆西丁加樣回收率試驗

2.7檢測限與定量限

采用信噪比法確定檢測限與定量限，用LC-MS測定茜草中蘆西丁時，定量限為1.73 ng/mL（S/N＝10），檢測限為0.52 ng/mL（S/N＝3）。

2.8樣品含量測定

分別取茜草飲片粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液10 mL，密塞，稱定質量，放置過夜，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，按“2.1”項下檢測條件測定，結果見表2。

表2　樣品含量測定結果

3　討論

本研究最初嘗試用HPLC-UV法測定茜草飲片中蘆西丁的含量，結果顯示，該法的定量限為8 μg/mL，高于實際藥材供試品溶液中蘆西丁含量，因此無法作為該成分的定量檢測手段。此后采用LC-MS法，該法的定量限為1.73 ng/mL，檢測靈敏度大大提高，經方法學考察確認，可作為茜草藥材中蘆西丁含量測定方法的專屬手段。

不同基原中藥的化學成分有時品種差異不大，國外對某些藥材品種的有毒成分的研究值得引起藥學工作者的重視，檢測毒性成分是否同樣存在于同類中藥材中并將其定量，對于中藥的安全用藥及擴大中藥材的應用范圍具有重要的指導意義。

[1] 王升啟,馬立人.茜草屬藥用植物的化學成分及生物活性[J].軍事醫學,1991(4)：254-259.

[2] 陳四保,馮瑞芝,陳碧珠,等.茜草屬藥用植物的研究Ⅰ.中藥茜草的原植物與國內資源[J].天然產物研究與開發,1991,3(4)：7-15.

[3] WESTENDORF J, POGINSKY B, MARQUARDT H, et al. The genotoxicity of lucidin, a natural component of Rubia tinctorum L., and lucidinethylether, a component of ethanolic Rubia extracts[J]. Cell Biol Toxicol,1988,4：225-239.

[4] KAWASAKI Y, GODA Y, YOSHIHIRA K, et al. The mutagenic constituents of Rubia tinctorum[J]. Chem Pharm Bull,1992,40(6)：1504-1509.

[5] YASUI Y, TAKEDA N. Identification of a mutagenic substance in Rubia tinctorum L.(madder) root, as lucidin[J]. Muta Res,1983, 121：185-190.

[6] FRANTISEK M, IVANA K, ALEXANDER J. Mutagenicity of natural anthraquinones from Rubia tinctorum in the drosophila wing spot test[J]. Planta Med,2001,67：127.

[7] WESTENDORF J, PFAU W, SCHULTE A. Carcinogenicity and DNA adduct formation observed in ACI rats after long-term treatment with madder root, Rubia tinctorum L.[J]. Carcinogenesis,1998,19：2163-2168.

Content Determination of Lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma by LC-MS

PU Yi-qiong,DING Yue, WANG Bing, ZHANG Ruo-xi, ZHANG Tong
(Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Objective To develop a LC-MS method for the content determination of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma. Methods Agilent 1290 HPLC and G6460 Mass were used for quantification in MRM mode under ESI-. chromatography was performed on a Agilent Eclipse Plus C18RRHD column (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) at 30 ℃using acetonitrile-0.1% formic acid in water at the flow rate of 0.4 mL/min. The injection volume was 2 μL. Results Good linearity was obtained from concentration of lucidin among the range of 0.005 2–2.64 ng (r= 0.999 9). Recoveries at different concentrations (80%, 100%, 120%) were between 94.80% and 100.94% (AVE=97.17%, RSD=6.16%). Good reproducibility and precision were also achieved. Conclusion The new developed LC-MS method is sensitive, accurate and with good repeatability, which is suitable for the content determination of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma. It can be used in the limit detection of lucidin in Rubiae Radix et Rhizoma.

Rubiae Radix et Rhizoma; lucidin; LC-MS

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.023

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0096-03

上海市科學技術委員會科研計劃項目（11DZ1971500）；上海市衛生局青年科研項目（20124Y002）

張彤，E-mail：zhangtdmj@hotmail.com

（2015-12-28）

（2016-01-20；編輯：陳靜）