ERCC1 mRNA表達(dá)水平與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步放化療療效相關(guān)性的臨床研究

陳紹俊，吳夢(mèng)馨，韋曉謀，黃海欣，尹 平

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖北 武漢 430022;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科，廣西 柳州 545005；3.上饒市人民醫(yī)院腫瘤科，江西 上饒 334000；4.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545005)

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ERCC1 mRNA表達(dá)水平與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步放化療療效相關(guān)性的臨床研究

陳紹俊1,2，吳夢(mèng)馨3，韋曉謀4，黃海欣1，尹 平2

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖北 武漢 430022;2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科，廣西 柳州 545005；3.上饒市人民醫(yī)院腫瘤科，江西 上饒 334000；4.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤分子實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545005)

目的 探討鼻咽癌組織中DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)的mRNA表達(dá)水平與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步放化療療效關(guān)系。方法 78例初診經(jīng)鼻咽腫物活檢確診為鼻咽部低分化鱗癌的Ⅱ期鼻咽癌患者,取患者化療前腫瘤組織通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)其ERCC1 mRNA表達(dá)水平，患者均接受順鉑同步放化療。通過(guò)RECIST 1.1實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定近期療效，分析ERCC1 mRNA表達(dá)水平與近期療效的關(guān)系。結(jié)果 78例患者均可評(píng)價(jià)療效，有效率為89.74%，疾病控制率為94.87%。Ⅱ期鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA的中位數(shù)水平為1.119。化療前Ⅱ期鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA的表達(dá)水平與治療后的近期療效有顯著相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 ERCC1 mRNA表達(dá)水平對(duì)Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步化療療效及預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1；Ⅱ期鼻咽癌；順鉑

DNA切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1(excision repair cross-complementing group1, ERCC1)是核苷酸切除修復(fù)途徑中重要成分，通過(guò)修復(fù)鉑類-DNA復(fù)合物的切除影響鉑類藥物療效。ERCC1的表達(dá)在預(yù)測(cè)患者鉑類化療療效方面有一定的價(jià)值，但報(bào)道的均以免疫組化表達(dá)居多，鼻咽癌組織中的mRNA表達(dá)及相關(guān)性目前報(bào)道甚少，本研究通過(guò)RT-PCR法對(duì)化療前鼻咽癌組織中ERCCl mRNA的水平進(jìn)行測(cè)定，分析ERCC1 mRNA的表達(dá)與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步化療療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科及區(qū)內(nèi)多家三甲醫(yī)院2007年6月至2015年6月經(jīng)鼻咽部活檢確診為鼻咽部低分化鱗狀細(xì)胞癌的患者共78例，男60例，女18例；年齡15～73歲，中位年齡46歲。按AJCC第7版鼻咽癌分期標(biāo)準(zhǔn)：T120例，T258例；N020例，N158例；M078例。所有患者均符合以下條件:1)預(yù)期生存期>6個(gè)月;2)體力評(píng)分0～2分;3)中性粒細(xì)胞≥1.5×109·L-1，血小板≥100×109·L-1，血肌酐<12 mg·L-1，總膽紅素、ALT、AST及AKP≤2.5倍正常參考值上限，均可評(píng)價(jià)近期療效。

1.2 治療方法 所有患者均接受順鉑同步放化療的治療模式?；煼桨笧轫樸K(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20040813)80 mg·m-2靜脈滴注，放療于d1、d22、d43進(jìn)行。放療采用6 MV直線加速器，調(diào)強(qiáng)放療，常規(guī)分割照射，5次/周，具體劑量：PGTVnx 70.06 Gy/31次、PGTVnd 70.06 Gy/31次，PTV1 66.03 Gy/31次、PTV2 54.25 Gy/31次。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 鼻咽癌組織中的RNA提取及檢測(cè) 取100 mg鼻咽癌組織按照Trizol RNA提取液試劑盒說(shuō)明書的方法抽提組織RNA。將提取出的RNA溶液保存于-80 ℃冰箱備用。以瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)RNA的純度及完整性。

1.3.2 基因組cDNA合成及PCR擴(kuò)增 逆轉(zhuǎn)錄cDNA：使用日本Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。首先去除基因組DNA：取總RNA 1 μg，加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、最后補(bǔ)足無(wú)RNA酶水至10 μL。室溫放置30 min。逆轉(zhuǎn)錄：取去除基因組后的總RNA 10 μL，加入 Prime Script RT Enzyme MIX 1.0 μL、RT Prime MIX 1.0 μL、5×Prime Script r Buffer 2 4.0 μL加水至20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s、4 ℃保存。PCR擴(kuò)增：ERCC1引物及擴(kuò)增條件：由日本Takara公司設(shè)計(jì)合成，使用Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)。ERCC1引物：上游引物：CCGCCAGCAAGGAAGAAA；下游引物：CTGCCGAGGGCTCACAAT，產(chǎn)物長(zhǎng)度為278 bp。GAPDH上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGT；下游引物:CTTCCACGATACCAAAGTTGT，產(chǎn)物長(zhǎng)279 bp。使用日本Takara公司試劑，取Ex Taq Version 2.0 plus dye 12.5 μL，加入cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL，最后補(bǔ)足水至25 μL。用美國(guó)ABI公司PCR儀將目的基因ERCC1和內(nèi)參基因GAPDH同時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：98 ℃ 5 s，54.5 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸后置4 ℃保存。產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠上(含1‰ gelred染料)以100 V電壓直流電泳1 h，在美國(guó)BIO-RAD公司凝膠成像儀上掃描定量ERCC1及GAPDH的光密度積分值，并以ERCCl與GAPDH比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 療效評(píng)價(jià)及生存記錄 采用鼻咽部MRI影像學(xué)檢查方法作為療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，參照RECIST 1.1版標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)：所有已知病灶消失并保持4周以上，定義為完全緩解(CR)；腫瘤最大單徑之和減少30%以上，并保持4周以上，定義為部分緩解(PR)；腫瘤最大單徑之和減少不超過(guò)30%或增加不超過(guò)20%，并保持4周以上，定義為病情穩(wěn)定(SD)；腫瘤最大單徑之和增加20%以上或出現(xiàn)新病灶，定義為疾病進(jìn)展(PD)，以CR+PR計(jì)算有效率，以CR+PR+SD計(jì)算疾病控制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 近期療效 全組78例患者均可評(píng)價(jià)近期療效，CR 51例(65.38%)，PR 19例(24.36%)，SD 4例(5.13%)，PD 4例(5.13%)，有效率為89.74%，疾病控制率為94.87%。

2.2 ERCC1 mRNA RT-PCR結(jié)果 78例鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA水平0.456～1.412，中位值為1.119。

2.3 鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)ERCC1 mRNA表達(dá)的中位值水平將>中位值水平視為高表達(dá)，≤中位值水平視為低表達(dá)，78例患者的鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、T分期、N分期、M分期無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ERCC1 mRNA表達(dá)水平與Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步放化療療效的關(guān)系 ERCC1低表達(dá)組41例中，CR 31例，PR 9例，SD 1例，PD 0例，有效率為97.56%，ERCC1 mRNA高表達(dá)組37例中，CR 20例，PR 10例，SD 3例 PD 4例，有效率81.08%，2組有效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)。化療有效組的ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量中位值為1.110，而化療無(wú)效組為1.140。

3 討論

鼻咽癌的治療以放療為主，在初診患者中，T2N0～1M0或T1N1M0的Ⅱ期鼻咽癌占據(jù)了一定的比例，然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)于Ⅱ期鼻咽癌如何治療沒(méi)有統(tǒng)一的定論，由于Ⅱ期鼻咽癌國(guó)內(nèi)外的Ⅱ期臨床研究并不多,Ⅲ期臨床研究有限,至今缺乏充足的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持應(yīng)采用何種建議。對(duì)于Ⅱ期鼻咽癌，美國(guó)NCCN診療指南把其歸類為局部區(qū)域晚期鼻咽癌，推薦按局部區(qū)域晚期鼻咽癌治療模式采用同步放化療+輔助化療。

在鼻咽癌的治療模式中，目前大部份研究報(bào)道表明在包括鼻咽癌的頭頸部腫瘤治療中使用含鉑類的同步放化療方案可取得較好的療效，大樣本量的Meta分析已證實(shí)了同步放化療在生存方面的優(yōu)勢(shì)。在循證醫(yī)學(xué)的指導(dǎo)下，含鉑類的同步放化療方案為當(dāng)前局部區(qū)域晚期鼻咽癌治療的標(biāo)準(zhǔn)手段，其對(duì)總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率的顯著提高得到了公認(rèn)[1-2]。然而,臨床上有相當(dāng)一部分局部區(qū)域晚期鼻咽癌患者并不能從以鉑類為基礎(chǔ)的同步化療中獲益[3-5]。

ERCC1是一段長(zhǎng)約15 kb的修復(fù)基因，定位于人類染色體 19q13.2～q13.3上，ERCC1基因在核苷酸的切除修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用，可修復(fù)受損的DNA。是DNA修復(fù)NER途徑中關(guān)鍵基因，ERCC1具有修復(fù)損傷DNA5′的識(shí)別功能，而且具有核酸內(nèi)切酶的活性[6]。鉑類藥物的主要作用機(jī)制是與DNA上的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶結(jié)合形成Pt-DNA加合物，導(dǎo)致DNA的鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，引起DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。而ERCC1本身基因的核苷酸序列異常會(huì)影響ERCC1 mRNA和其蛋白水平的表達(dá)，使得個(gè)體對(duì)鉑類藥物的敏感性會(huì)產(chǎn)生差異，影響鉑類藥物療效。ERCC1的高表達(dá)可使停滯在G2/M期的損傷DNA出現(xiàn)迅速修復(fù)，導(dǎo)致其可能對(duì)鉑類藥物耐藥。既往眾多文獻(xiàn)報(bào)道ERCC1和鉑類藥物的敏感性有密不可分的關(guān)系，大部分研究均認(rèn)為ERCC1在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中的表達(dá)水平可以成為預(yù)測(cè)鉑類藥物化療效果的指標(biāo)，并與疾病無(wú)進(jìn)展生存期及總生存期均有關(guān)[6-12]。研究涉及非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤，但有關(guān)ERCC1表達(dá)與鼻咽癌順鉑同步放化療敏感性關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，曹軼林等[13]報(bào)道了晚期鼻咽癌患者腫瘤組織中ERCC1的蛋白表達(dá)水平似乎與以鉑類為基礎(chǔ)化療的敏感性密切相關(guān)，也許可作為化療效果預(yù)測(cè)因子，但ERCC1的mRNA表達(dá)水平與鼻咽癌的相關(guān)性至今未見(jiàn)報(bào)道。

本研究檢測(cè)了ERCC1 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況,并預(yù)測(cè)其可否指導(dǎo)鉑類藥物在鼻咽癌治療中的使用。研究結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織中ERCC1 mRNA是存在表達(dá)的，其表達(dá)水平0.456～1.412，中位值為1.119。ERCC1 mRNA高表達(dá)組有效率81.08%(30/37)，低于ERCC1低表達(dá)組的97.56%(40/41)；化療有效組的ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量中位值為1.11，低于化療無(wú)效組的1.14。我們考慮ERCC1 mRNA的表達(dá)水平在鼻咽癌組織中可能可以作為鉑類化療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總之，ERCC1 mRNA表達(dá)水平對(duì)Ⅱ期鼻咽癌順鉑同步化療療效及預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但是鑒于目前化療分子標(biāo)志物的檢測(cè)的結(jié)果不盡如人意，我們認(rèn)為需要擴(kuò)大樣本量，開(kāi)展大規(guī)模的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)深入研究進(jìn)一步證實(shí)明確。

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Relationship Between Expression of ERCC1 mRNA and Effect of Cisplatin Concurrent Radiochemotherapy for Stage Ⅱ Nasopharyngeal Carcinoma

Chen Shaojun1,2, Wu Mengxin3, Wei Xiaomou4, Huang Haixin1, Yin Ping2

(1.SchoolofPublicHealth,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China;2.DepartmentofOncology,theFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005,China;3.DepartmentofOncology,thePeople’sHospitalofShangrao,Shangrao334000,China;4.TumorMolecularLaboratory,theFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005)

Objective To investigate the relationship between the expression of excision repair cross-complementing gene 1 (ERCC1) mRNA of stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma and effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for nasopharyngeal carcinoma.Methods RT-PCR method was used to detect the expression of ERCC1 in 78 patients with stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma before treatment, and all the 78 patients were treated with cisplatin concurrent radiochemotherapy. The short-term effect was evaluated by RECIST 1.1 solid tumors evaluation criteria, and the relationship between the expression of ERCC1 mRNA and effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma was analyzed.Results Of all the 78 patients, the effective rate was 89.74%, the disease control rate was 94.87%. The median of ERCC1 mRNA expression levels was 1.119. The expression of ERCC1 mRNA was positively related with effect of cisplatin concurrent radiochemotherapy for nasopharyngeal carcinoma.Conclusion The predictive value of expression of ERCC1 mRNA is clear for efficacy of cisplatin chemotherapy in the treatment of stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma.

excision repair cross-complementing gene 1; stage Ⅱ nasopharyngeal carcinoma; cisplatin

廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：2011GXNSFA018236)；柳州市重大項(xiàng)目(編號(hào)：2014J030404 )

陳紹俊(1979-)，女，碩士，教授，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤的綜合治療工作。E-mail:chenshaojun388@163.com

尹平(1965-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與應(yīng)用研究。E-mail：ping_y2000@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.002

R739.63；R730.58

A

1673-5412(2016)05-00373-04

2016-07-22)