牛磺酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響

李靜 楊雅娟 李常娟 馮艷

摘要：目的 觀察牛磺酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用四氯化碳復(fù)合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組和牛磺酸低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。治療4周后，生化分析儀測(cè)定大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）含量；ELISA測(cè)定大鼠血清肝纖4項(xiàng)[Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）]含量以及肝組織羥脯氨酸（HYP）水平；血流動(dòng)力學(xué)法測(cè)定大鼠門靜脈壓（PVP）、門靜脈血流量（PVF）、平均動(dòng)脈壓（MAP）并測(cè)定心率（HR）；硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮（NO）含量，化學(xué)比色法測(cè)定內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，放射免疫法測(cè)定環(huán)鳥苷酸（cGMP），紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；HE染色觀察大鼠肝組織病理形態(tài)。結(jié)果 與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清ALT、AST和TBIL含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），CⅣ、PCⅢ、HA及HYP含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），牛磺酸高劑量組LN含量顯著降低（P<0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠PVP、PVF顯著降低（P<0.05），牛磺酸高劑量組MAP顯著升高且HR顯著降低（P<0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織NO含量顯著升高（P<0.05，P<0.01），牛磺酸高劑量組eNOS活性、cGMP含量顯著升高（P<0.05）；牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；牛磺酸各劑量組大鼠肝組織病變明顯改善，其中牛磺酸高劑量組效果最為顯著。結(jié)論 牛磺酸對(duì)肝硬化門靜脈高壓大鼠具有抑制作用，其機(jī)制可能與牛磺酸保肝降酶，抑制氧化應(yīng)激損傷，上調(diào)eNOS表達(dá)、提高NO含量，改善肝功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞：牛磺酸；四氯化碳；肝硬化；門靜脈高壓；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.016

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）09-0065-05

Effects of Taurine on Rats with CCl4-induced Portal Hypertension LI Jing， YANG Ya-juan， LI Chang-juan， FENG Yan （First Hospital of Handan， Handan 056002， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of taurine on rats with CCl4-induced portal hypertension； To discuss its mechanism of action. Methods CCl4 compound method was used to prepare portal hypertension rat models. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group and low-， medium- and high-dose taurine groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. After four-week treatment， biochemical analyzer was used to detect the contents of ALT， AST and TBIL； ELISA was used to detect the contents of CⅣ， PCⅢ， LN， HA and the level of HYP in serum； hemodynamic method was used to detect PVP， PVF， MAP and HR； nitrate reduction method was used to detect the contents of NO， chemical colorimetry was used to detect the activity of eNOS， hepatic tissue； the activity of SOD， GSH-Px and the content of MDA in hepatic tissue； HE staining was used to observe the histopathological changes of the hepatic tissue. Results Compared with the model group， the contents of ALT， AST and TBIL in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； the contents of CⅣ， PCⅢ， HA and HYP in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly， and LN in high-dose taurine group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； the PVP， PVF in medium- and high-dose taurine groups and the HR in high-dose taurine group decreased significantly （P<0.01）， and the MAP in high-dose taurine group inecreased significantly （P<0.05）； the content of NO in hepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly （P<0.05， P<0.01）； the activity of eNOS and the content of cGMP in high-dose taurine group increased significantly （P<0.05）； the activity of SOD， GSH-Px in hepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly and the content of MDA decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； the hepatic tissue histopath-ological changes of low-， medium- and high-dose taurine groups were significantly improved， especially the high-dose taurine group. Conclusion Taurine has inhibitory effects on rats with portal hypertension， which perhaps are related to its effects on enzyme activity inhibition and hepatic tissue protection， inhibiting the damage of oxidative stress， upregulating eNOS expression， enhancing the content of NO and improving liver function.

Key words： taurine； CCl4； cirrhosis； portal hypertension； rats

肝硬化患者多伴有門靜脈高壓，是影響肝硬化患者預(yù)后的重要因素。牛磺酸是一種含硫β-氨基酸，是牛黃的重要成分，并且廣泛存在于動(dòng)物組織細(xì)胞中。現(xiàn)代藥理研究表明，牛磺酸具有促進(jìn)膽汁排泄、抗氧化、保護(hù)心血管、抑制肝組織纖維化等生物學(xué)作用[1-4]。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳復(fù)合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型，觀察牛磺酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性清潔級(jí)SD大鼠96只，7周齡，體質(zhì)量200～250 g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（冀）2008-1-003。飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃、相對(duì)濕度60%～70%的環(huán)境，人工光照明暗交替12 h/12 h。

1.2 藥物

牛磺酸，美國Sigma公司，批號(hào)140213，含量≥98%；復(fù)方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，批號(hào)20140624。

1.3 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）檢測(cè)試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、羥脯氨酸（HYP）、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、環(huán)鳥苷酸（cGMP）檢測(cè)試劑盒，北京博奧森生物工程有限公司。BS380生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），紫外-可見光分光光度計(jì)（日本島津），DNM-9602酶標(biāo)儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），AOWERLAD-85型八道生理記錄儀（AD公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

大鼠皮下注射40%四氯化碳0.3 mL/100 g，3 d注射1次，并給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，15%乙醇作為飲用水，6周后病理檢查證實(shí)肝硬化大鼠模型制備是否成功。選取80只成模大鼠，隨機(jī)分為模型組、陽性藥組和牛磺酸低、中、高劑量組，每組16只，并另取16只同齡正常大鼠作為正常組。取牛磺酸精確稱量，用生理鹽水配制成濃度為300 mg/mL溶液為中劑量，150、600 mg/kg牛磺酸溶液分別為低、高劑量；取復(fù)方鱉甲軟肝片準(zhǔn)確稱量，用生理鹽水配制成濃度為270 mg/mL的溶液。各給藥組均腹腔注射相應(yīng)劑量藥液2 mL/kg，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)4周。

2.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和總膽紅素含量測(cè)定

腹腔注射烏拉坦麻醉，開腹、經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，1500 r/min離心10 min，取血清，生化檢測(cè)儀測(cè)定大鼠血清ALT、AST、TBIL含量。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3 血清肝纖4項(xiàng)含量測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)所備血清，ELISA測(cè)定大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 肝組織羥脯氨酸水平測(cè)定

待“2.2”項(xiàng)取血完成后，取肝臟，剪碎后通過勻漿器進(jìn)行研磨勻漿，10 000 r/min離心15min，取上清液，ELISA測(cè)定大鼠肝組織HYP水平。嚴(yán)格按試劑說明進(jìn)行操作。

2.5 大鼠門靜脈壓、門靜脈血流量、平均動(dòng)脈壓和心率測(cè)定

腹腔注射烏拉坦麻醉，仰位固定，開腹并游離肝門靜脈主干，連接電磁流量計(jì)以測(cè)定門靜脈血流量（PVF）。門靜脈主干穿刺并固定，用于測(cè)定門靜脈壓（PVP），右頸動(dòng)脈插管用于測(cè)定平均動(dòng)脈壓（MAP）和心率（HR）。各指標(biāo)均由八道生理記錄儀測(cè)量并記錄。

2.6 肝組織一氧化氮、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、環(huán)鳥苷酸測(cè)定

取“2.4”項(xiàng)所備肝組織勻漿上清液，硝酸還原酶法測(cè)定NO含量、化學(xué)比色法測(cè)定eNOS活性，放射免疫法測(cè)定cCMP含量。嚴(yán)格按試劑說明進(jìn)行操作。

2.7 肝組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛含量測(cè)定

取“2.4”項(xiàng)所備肝組織勻漿上清液，紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2.8 肝組織病理形態(tài)觀察

治療結(jié)束后，腹腔注射烏拉坦麻醉，取肝臟，置于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片和展片處理，HE染色鏡下觀察大鼠肝組織病理形態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 牛磺酸對(duì)模型大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和總膽紅素含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量升高（P<0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 牛磺酸對(duì)模型大鼠血清肝纖4項(xiàng)、肝組織羥脯氨酸水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝組織HYP水平升高（P<0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠血清CⅣ、PCⅢ、HA含量及肝組織HYP水平降低（P<0.05，P<0.01），牛磺酸高劑量組大鼠血清LN含量降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4.3 牛磺酸對(duì)模型大鼠門靜脈壓、門靜脈血流量、平均動(dòng)脈壓和心率的影響

與正常組比較，模型組大鼠PVP、PVF、HR升高且MAP降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠PVP、PVF降低，牛磺酸高劑量組MAP升高、HR降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.4 牛磺酸對(duì)模型大鼠肝組織一氧化氮、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、環(huán)鳥苷酸水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織NO、cGMP含量和eNOS活性降低（P<0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織NO含量升高，牛磺酸高劑量組cGMP含量和eNOS活性升高（P<0.05）。結(jié)果見表4。

4.5 牛磺酸對(duì)模型大鼠肝組織超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物和丙二醛水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性降低及MDA含量升高（P<0.01）；與模型組比較，牛磺酸中、高劑量組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性升高及MDA含量降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表5。

4.6 牛磺酸對(duì)模型大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠肝組織呈結(jié)節(jié)狀，纖維組織增生顯著、纖維間隔形成，匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見炎細(xì)胞浸潤；牛磺酸各劑量組和陽性藥組大鼠肝組織病理形態(tài)改變顯著改善，并呈劑量依賴性。結(jié)果見圖1。

肝硬化是一種慢性肝病，將引發(fā)肝血管結(jié)構(gòu)紊亂及血流循環(huán)紊亂，最終導(dǎo)致門靜脈高壓形成，是導(dǎo)致肝硬化患者死亡的重要原因。通過四氯化碳復(fù)合法誘導(dǎo)制備的肝硬化大鼠模型具有與人類相似的肝硬化病理生理特征，多用于肝硬化門靜脈高壓的藥物治療研究[5-6]。

肝纖4項(xiàng)（CⅣ、PCⅢ、LN、HA）是臨床上用來監(jiān)測(cè)肝硬化進(jìn)展程度的常用指標(biāo)，并且在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中，膠原纖維大量增生，其主要成分為膠原蛋白，而HYP主要存在于膠原蛋白中，其含量反映肝硬化程度[7]。牛磺酸是一種含硫β-氨基酸，具有抗氧化、保護(hù)心血管、抑制肝組織纖維化等多種生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)采用通過四氯化碳復(fù)合法制備肝硬化門靜脈高壓大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸能有效降低肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量以及HYP水平，有效降低PVP、PVF、HR并提高M(jìn)AP水平，降低血清ALT、AST、TBIL的含量，改善肝組織的病理形態(tài)變化，并且上述作用均具有劑量依賴性。

體內(nèi)NO是一種信號(hào)分子，能夠通過激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶、升高細(xì)胞內(nèi)cCMP水平而發(fā)揮刺激血管舒張，促進(jìn)血液循環(huán)的生理作用[8]，而eNOS是體內(nèi)催化NO生成的生物酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能有效促進(jìn)肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織eNOS的表達(dá)，提高NO及cGMP的含量，提示牛磺酸能夠通過調(diào)節(jié)NO信號(hào)傳導(dǎo)通路，而表現(xiàn)出降低肝內(nèi)血管阻力和門靜脈壓力的作用，且該作用具有劑量依賴性。

SOD能夠通過提供氫原子配體而還原氧自由基生成H2O2[9]，并且在GSH-Px的催化作用下，能夠進(jìn)一步被還原生成對(duì)人體無害的H2O和O2[10]，從而消除氧化應(yīng)激損傷；脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量也能夠間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能有效改善肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，并且該作用具有劑量依賴性，提示牛磺酸能劑量依賴性地抑制肝硬化門靜脈高壓大鼠肝組織氧化應(yīng)激損傷。

綜上，牛磺酸對(duì)四氯化碳所致大鼠肝硬化門靜脈高壓具有劑量依賴性的抑制作用，其機(jī)制可能與牛磺酸能有效保肝降酶，抑制氧化應(yīng)激損傷，上調(diào)eNOS表達(dá)、提高NO含量，改善肝功能有關(guān)。

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