脲解型微生物誘導碳酸鈣沉積研究*

徐 晶，杜雅莉，白慧莉

(同濟大學 先進土木工程材料教育部重點實驗室，上海 201804)

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脲解型微生物誘導碳酸鈣沉積研究*

徐 晶，杜雅莉，白慧莉

(同濟大學 先進土木工程材料教育部重點實驗室，上海 201804)

研究了鈣源種類對脲解型微生物誘導碳酸鈣沉積的生物-化學過程的影響。利用電位分析法實時測試了沉積過程中鈣離子、銨離子及pH值的變化，并利用顯微計數對細菌濃度進行了監測。采用掃描電鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)和分析紅外光譜(IR)對沉積產物進行了研究。結果表明，不同鈣源環境下脲解型微生物誘導礦化沉積都存在化學沉淀、微生物誘導礦化沉積和沉淀完全3個階段；有機鈣源環境下細菌的產礦動力比在無機鈣源中高，且兩種鈣源所獲得的方解石晶體沉積物在形貌上差異顯著。

微生物；碳酸鈣沉積；礦化；裂縫修復

0 引 言

自1973年Boquet[1]首次發現并報道了土壤細菌誘導碳酸鈣晶體沉積現象以來，引發了各國學者競相開展生物修復材料在土木工程中的應用研究。Bang等[2-3]率先揭示了微生物沉積的機理，并證明了用聚亞安酯泡沫固定巴氏芽孢桿菌來修補加固混凝土裂縫可顯著提高結構的強度和完整性。錢春香等[4-5]側重開發了原位沉積技術，以實現對重大建筑工程和重要歷史建筑的表面防護和開裂修復。De Belie等[6-7]的研究表明，微生物沉積能夠有效減小毛細水吸附性以及氣體滲透性，并最終提升結構的耐久性。Jonkers等[8-9]研究了微生物沉積用于混凝土裂縫自修復的潛質，細菌在惡劣的環境中會形成芽孢并處于休眠狀態，而芽孢具有很強的抗逆性，且在基體開裂后遇水及氧氣可以復蘇，不斷進行礦化沉積并修復裂縫。J.Xu等[10]則對微生物修復后水泥基材料的宏觀和微觀力學性能進行了系統研究。相比傳統的修復加固，生物礦化沉積的反應條件溫和、負面效應弱且相容性好，是一種環境友好的修復技術。

對于利用微生物礦化沉積來實現裂縫修復，首要任務應探明其沉積過程。前期針對性的研究已涉及了該過程的機理及其受各因素的影響規律，包括pH值、溫度、濃度、鈣源及其濃度等，其中鈣源作為沉積過程中最關鍵的因素，相應系統性的研究較少。本文將從無機和有機兩類鈣源出發，研究其對脲解型微生物誘導礦化沉積過程的影響，以期為后續應用于混凝土裂縫修復提供指導。

1 實 驗

采用巴氏芽孢八疊球菌作為菌株。作為沉積前體的無機類鈣源通常使用氯化鈣和硝酸鈣[4]，但由于Cl-的存在會對混凝土的耐久性造成潛在影響，尤其是在有鋼筋的情況下[11]。因此本文選取硝酸鈣(calcium nitrate)作為無機鈣源的代表。而乳酸鈣(calcium lactate)作為研究最多的有機鈣鹽，在此處則選擇為有機鈣源的代表。為研究脲解型微生物的礦化沉積過程以及不同鈣源對礦化沉積的影響，分別設置了無菌的對照組，每組均平行測試3瓶樣品。另外，較高Ca2+濃度在堿性環境下容易發生化學沉淀，造成體系不穩，經參考既有文獻，最終設置鈣源濃度為0.025 mol/L[2]。各組培養基的組分如表1所示。

表1 各液體培養基組分

將未加菌的培養基置于錐形瓶中，在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌處理。菌株在30 ℃培養箱中恢復培養2 h后，無菌操作下轉接到冷卻后的前2組培養基中，使初始細菌濃度達到約105cell/mL，然后將錐形瓶放入恒溫水浴箱中30 ℃恒溫100 r/min振蕩培養。

礦化沉積結束后，采用Hitachi 2360S掃描電子顯微鏡表征錐形瓶壁上的沉積物形貌，并采用D/max 2550VB3+/PCX射線衍射儀對瓶壁上刮取的沉積物成分進行分析。剩余培養基在80 ℃下烘干后，采用EQUINOX55紅外光譜儀進行分析。

2 結果與討論

2.1 細菌誘導礦化沉積的生物-化學過程

細菌在礦化培養基中的生長情況如圖1所示。菌株轉接入礦化培養基的起始濃度約105cell/mL，在誘導期細菌濃度變化不大，22～26 h的對數期細菌濃度迅速升高，至穩定期時達到約107cell/mL水平。在總體趨勢上，有機鈣源中的細菌繁殖更活躍。對照組中由于未接種目標菌株，未觀察到細菌繁殖及生長，因此圖1未給出。

圖1 菌株的生長曲線

pH值變化如圖2所示。活菌組的趨勢都表現為先緩慢下降，隨后迅速上升，最后趨于平穩；對照組最初無顯著變化，后期則出現下降。

圖2 pH值曲線

Ca2+濃度變化如圖3所示。活菌組中Ca2+濃度在前30 h迅速下降，直到溶液內的游離Ca2+全部被結合并產生沉淀；對照組中的最初10 h Ca2+濃度出現降低，隨后保持平穩，表明后期未發生游離Ca2+被結合而產生沉淀的過程。

圖3 Ca2+濃度變化曲線

圖濃度變化曲線

按照鈣源類別的不同，將摻入活菌后的微生物礦化沉積過程進行分析，各參數的變化如圖5所示。

圖5 不同鈣源環境下微生物的礦化沉積過程

(1)

(2)

(3)

(4)

圖6 活菌試樣礦化沉積過程的動力學擬合

(5)

其中，x為時間，y為離子濃度，a為y的變化范圍，xc代表dy/dx最大時的時間值，k為動力學常數，k值越大即意味著動力越大。通過擬合獲得的k值如表2所示。

表2 不同鈣源培養基中CaCO3沉積及生成的動力學參數k值

在除鈣源以外的培養基成分相同的情況下，導致有機鈣源組中細菌生長繁殖的情況更好的原因與乳酸鈣在細菌代謝作用下生成CO2不無關系。已有研究指出，乳酸鈣在微生物代謝作用下發生的反應為[8]

(6)

2.2 XRD & SEM分析

圖7為有機及無機組試樣瓶壁沉積物的XRD譜，結果顯示沉淀物質為CaCO3，且均屬方解石晶型，這與其它研究者的實驗結果一致[12-13]。

圖7 沉積礦物的XRD圖譜

圖8為沉積產物的SEM照片。通過4組同倍數電鏡圖像的對比可發現，無機鈣源和有機鈣源沉積出來的方解石在形態上有所不同。硝酸鈣的沉積物形貌大多為球形及層片狀顆粒，粒徑尺寸<50 μm；乳酸鈣的沉積物則是不規則六面體及類球狀顆粒，且顆粒尺寸更大。在碳酸鈣的沉積過程中，許多外界條件都會直接影響碳酸鈣的晶型和形貌[14-15]。本文則進一步證實了，作為反應物之一的鈣源，其類別對沉積產物形貌有重要影響。

圖8 不同鈣源中沉積物的SEM圖像

圖中顆粒表面有許多長2～4 μm、寬0.7 μm的細印痕，這是菌體作為成核點后遺留下來的痕跡，表明菌株不僅通過新陳代謝生成的脲酶來促使方解石的沉積進行，其自身還起到了晶核的作用。

2.3 紅外光譜分析

圖9 培養基礦化沉積前后的IR圖譜

3 結 論

(2) 細菌不僅能產生脲酶促使CaCO3沉積，還作為晶核給晶體的形成提供條件。兩種鈣源環境下細菌誘導沉積得到的方解石在形貌上存在顯著差異：無機硝酸鈣環境下的沉積物大多為球形及層片狀顆粒，粒徑較小；有機乳酸鈣環境下的沉積物是不規則六面體及類球狀顆粒，且顆粒尺寸更大。

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Investigation on ureolytic microbiologically-induced calcium carbonate precipitation

XU Jing，DU Yali，BAI Huili

(Key Laboratory of Advanced Civil Engineering Materials (Tongji University),Ministry of Education, Shanghai 201804，China)

The effects of calcium source type on the bio-chemical processes of ureolytic microbiologically-induced calcium carbonate precipitation was investigated in this paper. By using potentiometric analysis, calcium ions concentration, ammonium ions concentration, and pH value were measured. Cell density was also monitored by microscopic counting method. Sediments were characterized by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and infrared spectroscopy. The results showed that the processes of microbiologically-induced calcium carbonate precipitation consists the abiotic precipitation stage, the microbiologically-induced calcium carbonate precipitation stage, and the calcium ions depletion stage, regardless of the calcium source type. The efficiency of bacterially-induce mineralized precipitation in organic calcium source environment is higher than that in inorganic calcium source environment. Significant morphological difference of precipitated calcites from two types of calcium sources was detected.

microorganism; calcium carbonate precipitation; mineralization; crack repair

1001-9731(2016)04-04001-05

國家自然科學基金資助項目(51378011)

2015-05-22

2015-10-26 通訊作者：徐 晶，E-mail: nanonewman@126.com

徐 晶 (1984-)，男，江西撫州人，博士，副研究員，從事水泥混凝土材料教學研究工作。

Q331

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.04.001