廣東地區200例正常人耳聾基因突變數據庫的建立

鄒俊 楊琳艷 羅俊明 梁志坤 楊旭 張麗紅★

·論著·

廣東地區200例正常人耳聾基因突變數據庫的建立

鄒俊1楊琳艷2羅俊明2梁志坤2楊旭3張麗紅1★

目的通過對200例廣東地區正常人進行耳聾基因突變篩查，獲得耳聾相關基因突變檢測的數據庫，初步篩出良性等位基因突變位點，以在對廣東地區人群進行耳聾基因突變檢測或篩查時，降低數據分析的時間和增加對結果的風險預測能力。方法提取在廣東地區收集到的200例正常男女樣本（男女比例為1∶1）的外周全血DNA，運用Ampliseq擴增技術以及Life Technologies耳聾基因檢測引物池構建基因文庫后進行下一代測序，確保每一個樣本的測序結果獲得足夠的數據量，然后分析耳聾基因突變位點。結果建立了使用Life Technologies耳聾基因檢測引物池構建基因文庫的實驗體系；經過數據比對，篩選出200例樣本中突變率高達80％～100％的良性等位基因突變點。結論通過對測序結果的分析處理，篩除了針對廣東地區人群突變率高但是不致病的良性耳聾基因突變位點，為今后廣東地區人群的耳聾基因突變篩查提供參考。

耳聾；下一代測序；良性等位基因

耳聾是一種臨床上最常見的、嚴重影響人類健康和生活質量的疾病，還會給社會帶來巨大的壓力。其發病原因多種多樣，環境影響、單基因突變、多基因復合突變以及環境和遺傳因素共同作用等都可能引起耳聾。在所有的耳聾患者中，約有一半屬于遺傳性耳聾。遺傳性耳聾可分為綜合征型耳聾（syndrom ic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（nonsyndrom ic hearing loss，NSHL）。目前為止，已有報道的耳聾有數百種，絕大多數的遺傳性耳聾屬于NSHL，只有約30％的遺傳性耳聾病例屬于SHL［1］。NSHL的遺傳模式涉及常染色體隱性、染色體顯性、X連鎖及線粒體遺傳等，其中線粒體遺傳約占1％［2］。其中常染色體隱性遺傳，約占77％；常染色體顯性遺傳，約占22％［3］。據遺傳學家估計，與耳聾相關的基因約有200多個，隨著分子遺傳學和分子生物學的發展以及人們對遺傳性耳聾的研究不斷深入［4］，目前近百個耳聾相關基因已經被發現，其中50多個非綜合征型遺傳性耳聾的基因被明確定位克隆。要減少遺傳性耳聾的發生，早期的預防與干預很重要，而對遺傳性耳聾進行預防與干預，重在對相關基因突變的檢測和篩查［5］。

Ion Torrent是基于半導體芯片發展起來的新一代革命性測序技術［6］，芯片的可測樣本量在提高的同時，相對應而產出的數據量亦是極為龐大的，在分析耳聾相關基因的測序結果時，實驗數據量的簡化顯得越來越重要。通過篩選后，如果建立起針對某一地區的耳聾基因突變數據庫，能快速排除掉人群中普遍存在的相關基因的良性突變位點或者多態位點，就可以為進一步的分析并確定致病性等位基因突變帶來很大的方便。本研究對來自廣東地區的200例正常人全血DNA樣本進行耳聾基因突變檢測，得到測序結果后，對數據進行分析整理后將高突變率的良性等位基因突變位點初步篩除，為今后廣東地區人群的耳聾基因篩查提供參考，減少樣本DNA測序及數據分析的工作量。

Ion Torrent半導體測序技術相關的技術平臺包含文庫構建、乳液PCR和測序?；驹硎窃诙嘀豍CR捕獲得到的DNA片段兩端加上通用的測序接頭，構建好可以用于測序的測序文庫。利用乳液PCR技術對測序文庫進行擴增，形成測序模板，通過對陽性模板進行富集以達到測序要求。利用半導體測序系統對構建好的測序模板進行測序，最終獲得每個DNA片段的堿基序列。通過生物信息學分析把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，分析樣本DNA序列覆蓋到耳聾相關基因的位置區域，統計確定位置的堿基序列信息，是否發生突變，發生突變的頻率為多少，即可判斷疾病類型，并且判斷為雜合突變或是純合突變，進而實現對耳聾相關基因型別的確定［7］。與第一代Sanger測序技術相比，該技術在很短的時間內能夠實現對上百億個堿基對進行測序的愿望，一次就可以測定幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列，這滿足了極短時間內對基因組進行高分辨率檢測的要求［8］。

1 材料和方法

1.1 研究對象和樣本

收集來自廣東地區正常男女外周全血樣本200例，其中，男性樣本100例（來自南方醫科大學南方醫院），女性樣本100例（其中11例來自南方醫科大學南方醫院，89例來自廣東地區其他醫院），男女比例為1∶1。耳聾患者外周全血樣本50例（來自南方醫科大學南方醫院）。使用QIAamp DNeasy Blood＆amp;Tissue Kit全血DNA提取試劑盒（具體操作按試劑盒說明書）對每個樣本取200μL進行基因組提取，后用Qubit?3.0熒光計和Nano?100微量分光光度計檢測所提取到的DNA濃度和純度。滿足濃度20～50 ng/μL，純度OD260/280=1.7～2.0。實驗檢測前DNA樣本在-80℃儲存。

1.2 文庫的制備

使用200例樣本中提取的全血基因組DNA進行基因組文庫構建，每個樣本取30 ng全血基因組進行實驗，使用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0和耳聾基因突變檢測引物池HearingLoss100v1（IAD2530702）（下稱panel，panel所覆蓋的基因如表1所示）（Life Technologies，美國）制備基因組文庫，利用AMPure XPbeads對文庫進行片段選擇和純化：0.5倍AMPure XP beads去除文庫中的大片段DNA；1.2倍磁珠可以捕獲理論大小的DNA文庫片段。

基因組文庫構建完成后，用Qubit?3.0檢測文庫濃度，Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies，美國）和安捷倫2100生物分析儀測定文庫片段大小。

表1 耳聾panel覆蓋的基因Table 1 Genes in deafness panel

1.3 模板制備和測序

將每個樣本的基因組文庫稀釋至100 pmol/L，將稀釋后的文庫每40個等量混合后，用Ion PI?Ion Sphere?Particles（ISPs）通過One Touch?2.0儀器進行乳液PCR，儀器運行結束后，再用Ion One?Touch?ES富集ISPs珠子。將富集后的ISPs珠子轉到Ion PI?Chip v3測序芯片上，使用Ion PITMHi?Q?Sequencing 200 Kit（Life Technologies，美國）試劑在Ion Proton測序儀上進行測序。

1.4 數據分析處理

測序完成后，待儀器內部緩存轉載至服務器上后，則可通過電腦連接服務器選擇相應插件進行數據處理和分析，則通過此步處理后可將測序得到的樣本的基因組序列定位到人類基因組參考圖譜上，分析樣本DNA序列覆蓋到耳聾相關基因的位置區域，統計確定位置的堿基序列信息，判斷是否發生突變。

2 結果

2.1 耳聾突變基因檢測文庫的構建體系

在試劑盒Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0提供的使用說明書的基礎上，我們對文庫構建的體系進行了優化，每個樣本文庫構建起始DNA量分別為19 ng、20 ng、21 ng，最后確定每個樣本文庫構建的起始DNA量至少為20 ng（低于20 ng時構建的文庫濃度低于0.2 ng/μL，而文庫濃度若低于0.2 ng/μL，將得不到測序結果）。因耳聾基因突變檢測panel有2個引物池，且每個樣本用2個引物池分別建庫，即每個耳聾基因突變檢測引物池進行目的片段擴增（PCR）時，加入的樣本DNA量至少為10 ng。所得文庫終濃度均可達到0.5 ng/μL以上。優化體系及結果如表2、表3所示。

表2 DNA起始量的優化Table 2 Optimization of initialdosage of DNA

2.2 檢測結果

使用耳聾基因突變檢測panel構建基因文庫后經測序所得數據顯示，該panel所覆蓋的63個耳聾相關基因（見表1）全部檢出，覆蓋度達100％。

200例正常樣本中，對耳聾相關基因進行突變檢測，其中50％以上的基因位點共35個，而本研究中80％～100％的樣本都存在突變位點共有25個（見表4）。

表3 文庫濃度對比Table 3 Comparison of library concentration

表4 突變頻率在80％～100％范圍內的基因位點的突變信息Table 4 Mutation information of gene sitewhichmutation frequency in the range of 80％～100％

2.3 數據庫建立有效性驗證結果

為了驗證我們建立起來的耳聾基因突變數據庫的有效性，對50例耳聾患者進行耳聾基因突變檢測，按照試劑盒Ion AmpliSeqTMLibrary Kit2.0的說明書構建基因組文庫，并且進行模板制備和上機測序，分析上機數據，選取其中1例耳聾患者樣本在良性突變位點篩除前數據分析的結果與良性突變位點篩除后分析數據的結果進行對比如表5、表6。經過對比可以看出建立數據庫后，處理數據時可以直接將良性的突變位點篩除掉，而只顯示我們需要的致病的突變位點信息，從而驗證了耳聾基因突變數據庫的有效性，這樣也大大減少了工作量，并且節省了數據分析的時間。

3 討論

與耳聾相關的基因較多，而且遺傳異質性較強，但大多數耳聾是由少數幾個基因突變導致的［11］，這為臨床開展耳聾基因診斷及產前診斷提供了檢測目標基因。目前結合產前診斷，耳聾基因突變檢測的目標人群主要有：聾人人群、新生兒以及部分聽力正常的人群。新生兒聽力篩查中有相當一部分攜帶GJB2、SLC26A4基因突變或線粒體DNA突變的兒童表現為聽力正常，但隨著年齡增長，聽力逐漸下降，表現為遲發性耳聾的癥狀［12］。因此，對他們進行基因突變檢測，能夠有效做到早發現、早預防、早干預，對提高兒童聽力健康水平具有重要的意義［13］。

表5 耳聾患者檢測結果（前）Table 5 Detection resultsof deafness patient（before）

表6 耳聾患者檢測結果（后）Table 6 Detection resultsof deafness patient（after）

隨著基因診斷技術的迅速發展，具有低成本、高通量、高自動化程度等特征的第下一代測序技術應運而生，該技術在很短的時間內能夠實現對上百億個堿基對進行測序的愿望，一次就可以測定幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列，這滿足了極短時間內對基因組進行高分辨率檢測的要求［12?14］。針對耳聾相關基因的篩查和檢測，目前使用最多的方法是基因測序技術，特別是近年來發展起來的高通量測序技術，已經廣泛應用于耳聾基因突變的篩查診斷中。在進行高通量的基因測序過程中，對結果中產生的大量數據進行高效、準確的處理成為一個不容忽視的問題，但由于基因突變具有普遍性、隨機性、不定向性等特點［14］，在測序過程中不可避免會有大量的非目標突變位點被檢測出來，如果能在繁雜的檢測結果中快速的分辨出致病的和新發的基因突變位點信息，則會

為數據分析帶來極大的方便。因此，高效的篩除良性突變位點或人群中多態位點的信息是很有必要的。

就耳聾基因突變檢測和篩查的現狀來看，一方面，根據報道目前還沒有成型的耳聾相關基因突變的數據庫，而且通過高通量測序法對正常人群或者聽力缺陷人群進行基因檢測，結果會發現相當一部分耳聾相關的基因突變位點是人群普遍攜帶的多態位點，如果不將其過濾掉，每次分析數據都需要重復篩除工作，造成不必要的工作負擔。另一方面，在耳聾基因的檢測方面，目前的生物學和醫學實驗室的工作重點是針對少量常見的耳聾基因突變位點進行檢測，在處理檢測結果時，不可避免要將一個大的數據背景排除，其工作量是很大的。同時由于外在環境以及人類個體之間的差異等原因，一些并非常見但又致病的基因突變位點確實是存在的，而且新發的突變位點在不斷地出現，因此針對一些不明原因的致聾，我們在篩查常見致病位點的同時，很有必要進行新發位點的查找和驗證。而這一工作要開展起來，首先也需要將人群中常見的、耳聾基因相關的非致病的多態位點篩除，以降低數據處理的難度。否則每次在處理數據時就如大海撈針一樣，需要在排除眾多的多態位點后再一一查找、驗證新發致病位點。因此，我們建立起來的針對廣東地區的200例正常人耳聾基因突變數據庫，經過生物信息學分析，NCBI數據庫檢索，可以有效地將驗證為良性的25個多態位點篩除，這樣就解決了前人在進行耳聾基因突變檢測是面對的大的數據背景難以排除的難題。并且對數據庫的有效性進行了驗證，選取50例耳聾樣本進行構建基因組文庫、模板制備和上機測序，與未使用數據庫分析的正常樣本的檢測結果進行對比，結果顯示我們建立起來的耳聾基因突變數據庫在后續耳聾基因突變位點篩查時可以直接有效地屏蔽掉相應的良性多態位點，這樣大大減少了要處理的數據量，降低了數據分析的時間、增加了對結果的風險預測能力，為今后廣東地區人群的耳聾基因突變篩查提供參考。

［1］韓躍峰，馬士崟.GJB2基因突變在遺傳性非綜合征性耳聾中的研究進展［J］.醫學綜述，2012，18（17）：2774-2777.

［2］王朝霞.線粒體病的分子診斷［J］.北京醫學，2014，36（4）：247-249.

［3］張秀菊，程靜，盧宇，等.一個常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系分析［J］.中華耳科學雜志，2014，12（1）：61-67.

［4］王繼.遺傳性耳聾的基因研究進展［J］.醫學綜述，2013，19（3）：442-444.

［5］陳鑫蘋，符征，符生苗，等.海南地區非綜合征遺傳性耳聾四個常見基因突變的分析［J］.現代檢驗醫學雜志，2014，29（5）：34-37.

［6］杜玲，劉剛，陸建，等.高通量測序技術的發展及其在生命科學中的應用［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（12）：109-115.

［7］周東艷.Ion Torrent PGM～（TM）平臺下一代測序技術在線粒體病診斷中的應用［D］.江西：南昌大學，2014.

［8］郭奕斌.基因診斷中測序技術的應用及優缺點［J］.遺傳Hereditas（Beijing），2014，36（11）：1121-1130.

［9］陳昊，譚曉風.基于第下一代測序技術的基因資源挖掘［J］.植物生理學報，2014，50（8）：1089-1095.

［10］林穎，蔣濤，季修慶，等.第下一代測序技術檢測1例假肥大型肌營養不良家系Dystrophin基因突變［J］.臨床檢驗雜志，2014，32（3）：185-187.

［11］王蘋，吳曉盼，賈志蓉，等.基因檢測在遺傳性耳聾中的應用［J］.中華健康管理學雜志，2008，2（6）：375-377.

［12］李磊，楊濤，吳皓.耳聾基因的篩查與診斷［J］.診斷學理論與實踐，2010，09（5）：409-412.

［13］劉爽.天津市新生兒聽力和聾病易感基因篩查情況分析［D］.天津：天津醫科大學，2013.

［14］吳寧.關于不定向變異和定向變異［J］.生物學教學，2010，35（8）：70.

Establishment of a gene mutation database in deafness from 200 health individuals in Guangdong area

ZOU Jun1,YANG Linyan2,LUO Junming2,LIANG Zhikun2,YANG Xu3,ZHANG Lihong1★
(1.Pediatric Surgery of JiangxiProvincial Children's Hospital,Nanchang,JiangxiChina,330006;2.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;3.School of Basic Medical Science, Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To get deafness related genemutation detection database and prelim inarily remove the positive allele mutations,200 cases of normal people in the Guangdong area were screened,in order to reduce the time of data analysis and increase the ability to predict the risk when detecting themutation of deafness gene in the population of the Guangdong area.Methods Peripheral blood DNA was extracted from 200 normal samples collected in the Guangdong area(male to female ratio of 1:1).Gene library was constructed by using Ampliseq amplification technology and primer pool of deafness genetic testing(Life Technologies),and then next generation sequencing was done.Results The experimental system of gene library was established using Life Technologies primer pools of deafness gene detection.Through data comparison,mutation rate between 80％and 100％of 200 sampleswas selected.Conclusion By analysing the sequencing results,deafness genemutationswhich were benign and had highmutation rate of population in Guangdong but not pathogenic were removed.That greatly reduced the time of data analysis,increased the ability to predict the results of the risk,which would provide reference for deafness genemutation screening of Guangdong population in the future.

Deafness;Nextgeneration sequencing;Benign allele

廣州市科技計劃項目（201508020259）

1.江西省兒童醫院兒外科，江西，南昌330006 2.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 3.南方醫科大學基礎醫學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：張麗紅，E?mail：742702096@qq.com