營養組合物對再生障礙性貧血小鼠肝干細胞的影響

營養組合物對再生障礙性貧血小鼠肝干細胞的影響

苗小艷賈莉楊佩滿1

(大連醫科大學檢驗醫學院，遼寧大連116044)

摘要〔〕目的探討營養組合物治療再生障礙性貧血(AA)的作用機制。方法BALB/c 小鼠100只隨機分組，分別給予相應處理，通過肝組織切片蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察肝細胞；紫外分光光度計檢測小鼠肝細胞線粒體DNA含量；流式細胞儀檢測肝干細胞(CD90+)。結果肝干細胞與正常對照組相比，AA模型組小鼠肝干細胞數量明顯減少，營養組合物處理AA小鼠后，小鼠肝干細胞的含量隨營養組合物劑量增加而增加，尤以高、中營養組合物組明顯(P<0.05)，表明營養組合物促進AA小鼠肝干細胞的增殖。結論營養組合物能夠明顯改善AA小鼠肝干細胞數量和結構，此可能為其治療AA的作用機制之一。

關鍵詞〔〕再生障礙性貧血；骨髓干細胞；肝干細胞；營養組合物；乙酰苯肼；環磷酰胺；CD90+；線粒體

中圖分類號〔〕R3〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：賈莉(1968-),女,教授,博士，博士生導師，主要從事細胞生物學研究。

1大連醫科大學組織胚胎學教研室

第一作者：苗小艷(1966-),女,實驗師,主要從事細胞生物學研究。

關于骨髓干細胞中的肝細胞，目前認為有可能是定向干細胞，在肝臟損傷的情況下直接分化形成肝細胞；也有可能是多能干細胞或殘留的胚胎樣原始細胞，在特定條件下通過分化或融合的方式產生肝細胞；還有可能是其他類型的干細胞，在肝臟損傷條件下通過橫向分化的途徑產生肝細胞〔1〕。CD90+是一種細胞表面糖蛋白，是肝干細胞的標志物，同時也是血液干細胞的抗原決定簇。本研究觀察自制營養組合物對再生障礙性貧血(AA)小鼠肝干細胞的影響，旨在為營養組合物的臨床應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗材料營養組合物(大連珍奧集團提供，由核苷酸、精氨酸、甘氨酸、卵磷脂、腦磷脂、維生素C、維生素B12、維生素E、鐵、葉酸、硒、葡萄籽提取物等組成，按原方比率配方，經水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用)；乙酰苯肼；環磷酰胺(上海華聯制藥有限公司)；兔抗小鼠CD90抗體；羊抗兔IgG；衛永超薄切片機；Epson微機；Summa Sketch PIus 數字化儀；Sigmascan軟件；流式細胞儀(FACS Calibur，美國Becton Dickinson公司)；紫外分光光度計。

1.2實驗動物及試驗流程BALB/c小鼠100只，雌雄各半，8～12周齡，18～22 g。由大連醫科大學實驗動物中心提供。小鼠AA模型建立：第1天給予小鼠皮下注射乙酰苯肼100 mg/kg，次日X射線2.0 Gy(美國瓦里安2300C/D，6 MV，X射線，照射距離25 cm，劑量率300 cGy/min)照射后，于第5天環磷酰胺80 mg/kg腹腔注射，第15天重復以上步驟但不給予射線處理。以鉛磚屏蔽施以假照射及單純等量生理鹽水相應部位注射為正常對照組。根據動物藥理學的藥品劑量和綜合實驗的設計分析，分為：①正常對照組；②AA模型組；③營養組合物高劑量組，以1 445.55 mg·kg-1·d-1對小鼠灌胃；④營養組合物中劑量組，以963.7 mg·kg-1·d-1對小鼠灌胃；⑤營養組合物低劑量組，以674.59 mg·kg-1·d-1對小鼠灌胃，每組20只。實驗流程：按前述AA小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、環磷酰胺及X射線照射。從第7天開始，營養組合物高、中、低劑量組分別以相應劑量對小鼠進行灌胃，每天一次，直至第45天，頸椎脫臼處死小鼠，進行下列檢測。

1.3實驗方法

1.3.1流式細胞儀分析將細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，離心(1 000 r/min，5 min)收集細胞，用PBS重懸為1×106/ml的細胞懸液，分別取200 μl轉移至Eppendorf管中，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，沉淀加入5%脫脂奶粉37℃封閉0.5 h。PBS洗滌一次，加入1∶200兔抗小鼠 CD90-多克隆抗體， 37℃孵育2 h。然后PBS洗滌一次，除去未結合的一抗。加入標記熒光素的羊抗兔IgG，工作濃度1∶1 000，37℃避光孵育0.5 h，PBS洗滌二次 (1 000 r/min，5 min)，用流式細胞儀檢測表達CD90+細胞數量變化，以標記抗體呈陽性的細胞百分率作為表達CD90蛋白(肝干細胞標志物)的計量標準。同時以只加標記熒光素的羊抗兔IgG和不加一抗、二抗的細胞作陰性對照。

1.3.2蘇木素-伊紅染色(HE染色)切片置于玻片架上，自來水沖洗，蘇木素染色10～15 min，自來水流水沖洗。然后置鹽酸酒精中2～3 min，熱水沖洗4～5 min， 至藍色反藍。伊紅染色1 min，自來水流水洗滌，分別經75%，85%，95%，100%酒精脫水。最后經自來水洗滌、吹干、封片、鏡檢。

1.3.3線粒體DNA含量測定將骨髓單個核細胞(5×107)、新鮮組織肝臟勻漿、裂解、離心，獲取線粒體。按照DNA提取試劑盒說明提取線粒體中的DNA，采用紫外分光光度計測量其含量。計算公式如下：DNA濃度(μg/μl)= A260×50 μg/ml ×稀釋倍數×10-1。

1.4統計學分析采用SPSS12.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1營養組合物對AA小鼠肝臟的影響肝病理切片HE染色顯示，與正常對照組相比，AA模型組小鼠肝臟組織水腫明顯，小葉結構欠清晰，大部分肝細胞胞質疏松、淡染，胞質內出現大小不等空泡，細胞核固縮，染色質深染，肝血竇及中央靜脈擴張，充血。不同劑量的營養組合物組與AA模型組比較，肝臟組織水腫減少，小葉結構明顯清晰，肝細胞形態正常，但低劑量組恢復的稍差一些，表明營養組合物對AA性貧血小鼠肝臟有顯著恢復作用。見圖1。

圖1　營養組合物對AA小鼠肝的影響(HE，×1 000)

2.2紫外分光光度計檢測肝細胞線粒體DNA含量與正常對照組相比，AA模型組小鼠肝細胞線粒體DNA的含量明顯下降〔(1.03±0.06)μg/ml vs (1.86±0.19)μg/ml,P<0.05〕；高、中、低劑量的營養組合物組〔(1.52±0.12) μg/ml、(1.24±0.1)μg/ml、(1.19±0.9)μg/ml〕與AA模型組比較，小鼠肝細胞線粒體DNA的含量明顯增高，呈量效關系(P<0.05)。

2.3流式細胞儀檢測肝干細胞(CD90+)與正常對照組相比，AA模型組小鼠肝干細胞數量明顯減少(2.26%±0.18% vs 11.67%±1.23%,P<0.05)，營養組合物處理AA小鼠后，小鼠肝干細胞CD90+的含量隨營養組合物劑量增加而增加(高、中、低劑量組分別為9.44%±0.84%、5.12%±0.43%、2.86%±0.25%,P<0.05)，表明營養組合物促進AA小鼠肝干細胞增殖。

3討論

近年來有證據證明人的骨髓造血干細胞也可轉化為肝干細胞，說明骨髓細胞和肝細胞間存在密切關系〔2〕。Petersen等〔3〕在實驗研究中也證實了人類骨髓細胞向肝細胞轉化的可能性。CD90+是一種細胞表面糖蛋白，是肝干細胞的標志物，同時也是血液干細胞的抗原決定簇。近幾年確定了幾種特定表達在干細胞和早期祖細胞的抗原，如CD90+(Thy-1)，KDR，CD133受體，其中CD90+被認為是造血干細胞的又一標志性抗原，在造血干祖細胞分化發育過程中CD90+先于CD34+分子出現，在早期造血干細胞中表達〔4〕，這可能對造血干祖細胞的研究提供新的途徑和新的方法。促進造血干細胞增殖與血紅蛋白合成營養組合物是將核苷酸等多種營養成分進行合理搭配，相互配合，其中甘氨酸為血紅素的基本原料，參與合成甘氨酰胺合成酶參加嘌呤核苷酸合成，利于造血干細胞增殖。腦磷脂、卵磷脂為線粒體及造血干細胞組分；核苷酸類營養物不僅有助于基因的復制、損傷基因的自主修復、基因表達，也有助于線粒體的增殖〔5〕。各種營養成分協同提高AA小鼠刺激骨髓造血干細胞的增殖，使造血干細胞和肝干細胞明顯增多，對骨髓的造血功能有明顯的促進作用；同時可明顯提高骨髓造血細胞和肝細胞內線粒體數目，對改善AA小鼠骨髓抑制狀態有顯著作用〔6〕。本實驗顯示營養組合物可使AA小鼠細胞線粒體病理變化改善，有效提高干細胞增殖與線粒體的數目，對骨髓造血微環境有明顯的保護和修復作用；能抑制跨膜電位下降及細胞凋亡，促進AA小鼠肝干細胞的增殖，可能機制為營養組合物能促進骨髓造血干細胞向肝干細胞發育、增殖、分化，并且改善骨髓造血微環境或骨髓重建。

4參考文獻

1鄭桃.肝干細胞的研究進展〔J〕.四川醫學，2011;33(10)：1660-2.

2洪國慶.肝干細胞在肝臟疾病中應用的研究進展〔J〕.檢驗醫學與臨床，2012;9(13)：1622-3.

3Petersen BE，Bowen WC，Patrene KD，etal.Bone marrow as a potential source of hepatic oval cell〔J〕.Science，1999;284(5417)：1168-70.

4Shimazaki C，Surnikuma T，Inaba T，etal.CD34+CD90+cells and late hematopoietic reconstitution after autologous periphera1 blood stem cell transplantation 〔J〕.Leuk Lymphoma，2004;45(4)：661-8.

5苗小艷，何菱，賈莉，等.營養組合物對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血細胞線粒體形態及跨膜電位的影響〔J〕.解剖科學進展，2010;16(5)：456-9.

6Lee JW.Tongue-folding and tongue-rolling〔J〕.J Hered，1950;45(1)：176.

〔2014-03-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)