構(gòu)樹(shù)葉提取物體外抗病毒活性研究

杜柏槐，劉曉軍，陳紹紅

( 1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088)

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構(gòu)樹(shù)葉提取物體外抗病毒活性研究

杜柏槐1，劉曉軍1，陳紹紅2*

( 1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088； 2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088)

[目的]研究構(gòu)樹(shù)葉提取物的抗病毒活性。[方法]采用MTT法，觀察構(gòu)樹(shù)葉的水、75%乙醇和50%丙酮提取物及不同給藥方式對(duì)NDV、IBDV、ILTV和IBV等病毒感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)活性的影響，探討構(gòu)樹(shù)葉提取物體外抗病毒活性及其作用機(jī)制。[結(jié)果]乙醇和丙酮提取物能顯著提高NDV感染的CEF細(xì)胞活性，丙酮提取物能顯著提高ILTV和IBV感染的CEF細(xì)胞活性，但對(duì)IBDV誘導(dǎo)的CEF細(xì)胞病變無(wú)影響。經(jīng)丙酮提取物預(yù)處理的CEF細(xì)胞對(duì)NDV或ILTV感染的抵抗力呈上升趨勢(shì)。[結(jié)論]構(gòu)樹(shù)提取物中的有效成分可能通過(guò)阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和粘附發(fā)揮其抗病毒活性。

構(gòu)樹(shù)葉；提取物；抗病毒活性

構(gòu)樹(shù)(Broussonetiapapyrifera(L.)Vent)是桑科、構(gòu)樹(shù)屬的一種落葉喬木，其根、莖、葉和果實(shí)均可入藥，具有消腫利尿、清熱利濕、補(bǔ)腎明目等功效[1]。研究證實(shí)，構(gòu)樹(shù)含有多種生物活性物質(zhì)，具有抗細(xì)菌[2]、抗真菌[3]、抗氧化[4-5]、抗炎[6]和抗腫瘤[7-8]活性。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)飼喂構(gòu)樹(shù)葉的畜禽對(duì)病毒感染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力，其發(fā)病率和死亡率均有不同程度的下降[8]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)樹(shù)葉的抗病毒活性成分，筆者觀察了構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)NDV、IBDV、IBV和ILTV等常見(jiàn)動(dòng)物病毒增殖的抑制作用，為篩選抗病毒中草藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。構(gòu)樹(shù)葉，采自廣東海洋大學(xué)優(yōu)質(zhì)牧草試驗(yàn)基地，由劉海博士鑒定，50 ℃干燥，粉碎過(guò)60目篩。SPF雞胚，購(gòu)自北京梅里亞公司，37.8 ℃孵化至10日齡備用。

1.1.2 試劑。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，MTT(美國(guó)Sigma公司)，臺(tái)盼藍(lán)、乙醇、丙酮均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 病毒。新城疫病毒(NDV，Roakin株)、傳染性法氏囊病毒(IBDV，BC6-85株)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV，SA-2株)、傳染性支氣管炎病毒(IBV，ZJ-K1株)，均由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉鈾教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)樹(shù)葉提取物的制備。將構(gòu)樹(shù)葉陰干粉碎，分別用蒸餾水、75%乙醇和50%丙酮浸泡3 h，紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)55 ℃減壓濃縮后冷凍干燥。

1.2.2 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的制備。取9～10日齡SPF雞胚用0.2%新潔爾滅、75%酒精依次消毒蛋殼，無(wú)菌采集胚體，去除頭、爪和內(nèi)臟，用眼科剪將胚體剪切成1～2 mm3大小的組織塊，PBS(pH 7.2)漂洗2～3次，加入0.25%胰酶于37 ℃水浴消化10 min，加入少量DMEM細(xì)胞維持液終止消化，上清液過(guò)60目篩，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用DMEM生長(zhǎng)液將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/mL[9]。

1.2.3 MTT法測(cè)定構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)CEF的毒性作用。將構(gòu)樹(shù)提取物用DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液2倍倍比稀釋?zhuān)尤?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔50 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)重復(fù)，分別加入等體積CEF細(xì)胞懸液，使細(xì)胞終濃度為1×105個(gè)/mL，另設(shè)4孔正常細(xì)胞對(duì)照。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞增殖與貼壁情況，3 d后取出培養(yǎng)板，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度，計(jì)算CEF細(xì)胞存活率，比較構(gòu)樹(shù)葉提取物的毒性作用[10]。細(xì)胞存活率=(處理組OD490/對(duì)照組OD490)×100%。

1.2.4 構(gòu)樹(shù)葉提取物體外抗病毒活性。將CEF細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種至96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，棄去培養(yǎng)液。根據(jù)“1.2.3”測(cè)定結(jié)果，用細(xì)胞維持液稀釋構(gòu)樹(shù)葉提取物至濃度為2.5 mg/mL，每孔50 μL，隨后加入100TCID50的病毒懸液50 μL，每種供試病毒做4個(gè)重復(fù)。另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(加100 μL的DMEM維持液)和病毒對(duì)照組(加入100TCID50的病毒懸液)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，觀察病毒引起的細(xì)胞病變(CPE)。當(dāng)病毒對(duì)照組出現(xiàn)75%以上CPE時(shí)，每孔加0.5% MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD490。

1.2.5 不同處理方式對(duì)構(gòu)樹(shù)葉提取物抗病毒活性的影響。用細(xì)胞維持液稀釋構(gòu)樹(shù)葉乙醇或丙酮提取物至終濃度為2.5 mg/mL。根據(jù)“1.2.4”的結(jié)果，以NDV、ILTV和IBV為供試病毒，分別進(jìn)行下列處理，檢測(cè)不同給藥方式對(duì)構(gòu)樹(shù)葉提取物的抗病毒活性。處理①構(gòu)樹(shù)葉提取物50 μL加至CEF細(xì)胞單層作用1 h后，再加入含100TCID50供試病毒懸液50 μL。處理②構(gòu)樹(shù)葉提取物50 μL與含100TCID50供試病毒懸液50 μL，混勻，37 ℃培養(yǎng)1 h后，加入CEF細(xì)胞單層培養(yǎng)孔。處理③構(gòu)樹(shù)葉提取物50 μL、含100TCID50供試病毒懸液50 μL，混勻，同時(shí)加入CEF細(xì)胞單層。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)樹(shù)葉提取物的制備 500 g構(gòu)樹(shù)葉經(jīng)水提取獲得70 g稠膏，提取率為14.0%；600 g構(gòu)樹(shù)葉經(jīng)75%乙醇提取獲得93 g稠膏，提取率為15.5%；600 g構(gòu)樹(shù)葉經(jīng)50%丙酮提取獲得160 g稠膏，提取率為16.0%。

2.2 構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)CEF的毒性作用 由表1可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液中3種構(gòu)樹(shù)提取物終濃度高于10.00 mg/mL時(shí)，對(duì)CEF細(xì)胞均有一定的毒性作用，表現(xiàn)為CEF細(xì)胞增殖速度降低，少數(shù)細(xì)胞變圓、上浮；當(dāng)終濃度低于2.50 mg/mL時(shí)，構(gòu)樹(shù)葉乙醇或丙酮提取物處理的CEF細(xì)胞存活率與對(duì)照組基本相同，且0.62～1.25 mg/mL乙醇提取物、0.31～2.50 mg/mL丙酮提取物對(duì)CEF細(xì)胞增殖還有一定促進(jìn)作用，但0.31 mg/mL水提取物處理的CEF細(xì)胞存活率仍低于對(duì)照組。

表1 構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞存活率的影響

注：培養(yǎng)72 h的正常原代CEF細(xì)胞存活率為(95.4±1.2)%。

Note：The vitality of primary CEF cells cultured for 72 h was(95.4±1.2)%.

2.3 構(gòu)樹(shù)葉提取物體外抗病毒活性 根據(jù)“2.2”試驗(yàn)結(jié)果，選擇終濃度為1.25 mg/mL的構(gòu)樹(shù)葉提取物，觀察其對(duì)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變的抑制作用。由表2可見(jiàn)，培養(yǎng)液添加構(gòu)樹(shù)葉提取物的CEF細(xì)胞的OD490顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞變圓、融合現(xiàn)象減少，細(xì)胞病變時(shí)間延遲，表明乙醇和丙酮提取物對(duì)NDV感染引起的CPE均有不同程度的抑制作用(P<0.05)；構(gòu)樹(shù)葉丙酮提取物能顯著提高ILTV感染的CEF細(xì)胞活性(P<0.05)，乙醇和水提取物無(wú)此活性；構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)IBDV感染引起的CEF細(xì)胞活性無(wú)影響(P>0.05)；在IBV感染的CEF細(xì)胞中，僅構(gòu)樹(shù)葉丙酮提取物具有一定的抗病毒活性(P<0.05)。

表2 構(gòu)樹(shù)提取物對(duì)病毒感染CEF細(xì)胞活性的影響(OD490)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

Note：Data within the same column marked with the different small letters mean significant difference compared to control group(P<0.05).

2.4 不同處理方式對(duì)構(gòu)樹(shù)葉提取物抗病毒活性的影響 與對(duì)照組相比，構(gòu)樹(shù)葉乙醇或丙酮提取物不同給藥方式對(duì)NDV引起的細(xì)胞病變有顯著的抑制作用(P<0.05)；構(gòu)樹(shù)葉丙酮提取物對(duì)ILTV引起的的細(xì)胞病變亦有顯著的抑制作用(P<0.05)，用乙醇提取物預(yù)處理能顯著提高ILTV感染的CEF細(xì)胞活性(P<0.05)，但乙醇提取物處理對(duì)ILTV感染性及其引起的細(xì)胞病變無(wú)明顯影響(P>0.05)；采用構(gòu)樹(shù)提取物預(yù)處理的CEF細(xì)胞活性有升高的趨勢(shì)，但各處理組間差異不顯著(P>0.05)。對(duì)IBV而言，僅丙酮提取物有顯著的抗病毒活性(P<0.05)，各處理組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 給藥方式對(duì)構(gòu)樹(shù)葉提取物抗病毒活性的影響(OD490)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

Note：Data within the same column marked with the different small letters mean significant difference compared to control group(P<0.05).

3 小結(jié)與討論

正常原代培養(yǎng)的CEF細(xì)胞呈梭狀，有良好的貼壁性。當(dāng)培養(yǎng)液中構(gòu)樹(shù)葉提取物終濃度達(dá)10.00 mg/mL時(shí)，CEF細(xì)胞活性下降，細(xì)胞變圓、脫落，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，CEF細(xì)胞存活率僅為40%左右，說(shuō)明構(gòu)樹(shù)葉提取物中的某些化學(xué)成分對(duì)CEF細(xì)胞具有一定毒性。當(dāng)構(gòu)樹(shù)葉提取物終濃度低于2.50 mg/mL時(shí)，添加構(gòu)樹(shù)葉提取物的各組CEF細(xì)胞存活率與對(duì)照組細(xì)胞大致相同。培養(yǎng)液中構(gòu)樹(shù)葉乙醇提取物終濃度為0.62～1.25 mg/mL、丙酮提取物終濃度為0.31～2.50 mg/mL時(shí)，對(duì)CEF細(xì)胞增殖具有一定促進(jìn)作用，部分抵消了構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)CEF細(xì)胞的毒性作用。因此，該試驗(yàn)中選擇終濃度為1.25 mg/mL的構(gòu)樹(shù)葉提取物，觀察其抗病毒活性。

NDV、ILTV、IBDV和IBV分屬于副粘病毒科、皰疹病毒科、雙鏈RNA病毒科和冠狀病毒科，除IBDV外，病毒表面均有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊膜，對(duì)表面活性劑或有機(jī)溶劑較敏感。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)樹(shù)葉丙酮提取物均能不同程度地提高NDV感染的CEF細(xì)胞活性，延緩CPE出現(xiàn)；乙醇提取物僅對(duì)NDV感染的宿主細(xì)胞有一定的保護(hù)作用；而水提取物對(duì)上述病毒感染均無(wú)明顯抑制作用。可見(jiàn)，構(gòu)樹(shù)葉抗病毒活性可能與其中的脂溶性化合物有關(guān)，這些化合物一方面通過(guò)阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞膜受體的識(shí)別和粘附；另一方面則通過(guò)與NDV、ILTV或IBV囊膜中的脂質(zhì)結(jié)合，進(jìn)一步阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞膜受體的識(shí)別，延緩病毒侵入和CPE出現(xiàn)，從而發(fā)揮其抗病毒活性。構(gòu)樹(shù)葉提取物對(duì)IBDV感染無(wú)抑制作用可能與該病毒表面缺乏囊膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。

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Study on Antiviral Activity ofBroussonetiapapyriferaLeaf Extractsinvitro

DU Bai-huai1, LIU Xiao-jun1, CHEN Shao-hong2*

(1. Agricultural College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088; 2. College of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088)

[Objective]The present work was aimed to study the antiviral activity ofBroussonetiapapyriferaleaf extracts. [Method] The MTT method was used to detect the effects of water, 75% ethanol and 50% acetone extracts ofB.papyriferaleaf and different treatments on chick embryofibroblast(CEF) infected by newcastle disease virus(NDV), infectious laryngotracheitis virus(ILTV), infectious bronchitis virus (IBV) and infectious bursal disease virus(IBDV) respectively, to explore the antiviral activity and mechanism ofB.papyriferaleaf extracts. [Result] The result showed that the vitality of the NDV infected CEF was significantly increased owing to ethanol and acetone extracts supplemented in the cell medium, the vitality of CEF infected by ILTV or IBV were also significantly improved by acetone extract addition, whereas the cytopathic effect induced by IBDV was not alerted byB.papyriferaleaf extracts. Moreover, the vitality of CEF pretreated by acetone extract, followed by NDV or ILTV infection, tend to be higher than that of other treatments. [Conclusion] It can be inferred that the effective components in theB.papyriferaextract may exert the antiviral effect by blocking virus recognition and adhesion to the host cells.

Broussonetiapapyriferaleaf; Extracts; Antiviral activity

廣東省農(nóng)業(yè)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(0809035)。

杜柏槐(1989- )，男，河南焦作人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫。*通訊作者，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事生物化學(xué)研究。

2016-08-15

S 853.7

A

0517-6611(2016)29-0144-03