青葙子提取物對小鼠糖尿病視網膜病血—視網膜屏障的保護作用及機制

郭樹鵬++++++楊進花++++++趙輝++++++余增洋

[摘要] 目的 觀察青葙子提取物（CAE）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的C57小鼠糖尿病視網膜病（DR）血-視網膜屏障（BRB）的改善作用，并進一步研究其可能機制。 方法 采用STZ誘導C57小鼠建立DR模型，然后給予DR小鼠CAE 100 mg/kg干預；通過檢測視網膜組織白蛋白（Albumin）滲漏和血管內皮生長因子（VEGF）表達觀察CAE對DR小鼠BRB破壞的影響；采用Western blot檢測視網膜組織Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1及p-NFκB、IκB、p-IKK的蛋白表達水平；采用ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。 結果 CAE能夠逆轉DR小鼠視網膜組織Albumin滲漏增加和VEGF表達的升高（P < 0.01）；CAE能夠上調DR小鼠視網膜組織降低的緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-5、Occludin表達（P < 0.05或P < 0.01），同時能夠抑制NFκB信號通路的激活（P < 0.01），并下調DR小鼠血清中增加的IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P < 0.01）。 結論 CAE具有保護STZ誘導DR小鼠BRB的活性，其機制為保護DR中減少的緊密連接蛋白表達，同時抑制了DR中炎性信號通路的激活。

[關鍵詞] 糖尿病視網膜病；青葙子；血-視網膜屏障；緊密連接蛋白；炎性信號

[中圖分類號] R774.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the amelioration of Celosia argentea L. extract （CAE） on the blood-retina barrier （BRB） of streptozotocin （STZ）-induced diabetic retinopathy （DR）， and to study its possible mechanism. Methods DR was induced by STZ injection in C57 mice and then the DR mice were given with 100 mg/kg CAE. The BRB breakdown was evaluated by the expression of Albumin leakage and VEGF. The levles of Claudin-1， Claudin-5， Occludin， ZO-1， p-NFкB， IκB and p-IKK were detected by Western blot. The levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum were quanlified by ELISA. Results The increased retinal Albumin leakage and VEGF expression were reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. The reduced retinal tight junction protein expressions of Claudin-1， Claudin-5 and Occludin were enhanced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.05 or P < 0.01）. The activation of NFкB signal pathway was inhibited by CAE and further the increased serum TNF-α， IL-1β and IL-6 amount was reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. Conclusion CAE ameliorates DR via improving BRB breakdown by attenuating inflammation and enhancing the retinal tight junction protein expression.

[Key words] Diabetic retinopathy； Celosia argentea L.； Blood-retina barrie； Tight junction protein； Inflammatory signal

糖尿病視網膜病（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴重的并發癥之一，已日漸成為影響成年人視力健康的最主要疾病。臨床上根據DR的發病進展，分為早期的非增殖性糖尿病視網膜病（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和后期的增殖性糖尿病視網膜病（proliferative diabetic retinopathy，PDR）[1]。早期NPDR階段的顯著標志是血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破壞和滲出增加，造成缺血缺氧狀態，若得不到緩解，將進展到后期的PDR階段，出現視網膜血管病理性增生，導致視力嚴重損害甚至失明[2-3]。

青葙子是傳統明目中藥，具有清熱瀉火、明目退翳的功效，臨床上常用于治療肝熱目赤、眼生翳膜、視物昏花等。本研究在建立小鼠早期NPDR模型基礎上，觀察了青葙子提取物（Celosia argentea L. extract，CAE）對BRB破壞的保護作用，進一步從CAE對NPDR小鼠緊密連接蛋白表達和炎癥信號通路的影響兩方面探討了CAE保護BRB的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

青葙子（Celosia argentea L.），經上海市寶山區中西醫結合醫院藥劑科熊波中藥師鑒定為莧科青葙屬青葙的干燥成熟種子。將青葙子藥材于60℃干燥12 h，粉碎后過40目篩，稱取50 g加入500 mL稀乙醇室溫條件浸漬24 h，時時搖動，抽提2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮除去溶劑，得到提取物浸膏。稱取適量浸膏，加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）研磨溶解，配成給藥溶液。

1.2 動物

SPF級健康雄性C57小鼠，5周齡，體重18～22 g，購自中科院上海實驗動物中心。飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽醫院吳涇分院實驗動物中心，12 h光暗循環，飼料與水消毒后自由攝取，適應性飼養1周后使用。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、多聚甲醛均購自國藥試劑；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA Kits均購自RapidBio公司；BCA Protein Assay Kit購自Thermo Scientific公司；ECL化學發光顯影液購自Millipore公司；本實驗所用抗體均購自CST公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物實驗 稱取適量STZ粉末避光溶解于緩沖液中，在1 h內立即給予已禁食過夜的小鼠腹腔注射，終劑量為55 mg/kg。連續5 d腹腔注射造模。正常小鼠給予相同體積緩沖液做為對照。末次造模1周后尾靜脈采血測血糖，血糖值高于16.7 mmol/L被認為糖尿病造模成功，然后隨機分為兩組：模型組和CAE組。CAE組小鼠2個月后開始予CAE灌胃給藥，最終給藥劑量為100 mg/kg，連續給藥30 d。每月監測血糖和體重。給藥結束后用烏拉坦麻醉小鼠，腹主動脈取血，立即摘取眼球，用于后續實驗。

1.4.2 小鼠視網膜組織Albumin滲漏檢測 小鼠左心室盥洗生理鹽水（37℃）以徹底清除體循環中血液，然后摘取雙側眼球進行Albumin滲漏檢測。

1.4.3 Western blot檢測視網膜組織相關蛋白表達 摘取小鼠眼球，于解剖顯微鏡下取出視網膜組織，加入lysis buffer于冰上超聲勻漿，勻漿液用低溫離心機（型號：5810R，Eppendorf公司）以10 000 r/min離心10 min，取出上清，蛋白定量，上樣，轉膜，封閉，加入一抗于4℃慢搖孵育過夜，用1×TBST洗3次后，與二抗室溫慢搖孵育1 h，用1×TBST洗3次后，加入ECL化學發光液反應1 min，置于凝膠成像系統拍照。

1.4.4 小鼠血清中炎癥細胞因子檢測 取小鼠血漿以2000 r/min離心10 min，移取上清即得血清，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按照試劑盒說明書操作。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體重及血糖水平比較

由表1可見，C57糖尿病造模小鼠從第13天開始血糖值均高于16.7 mmol/L且維持穩定，與正常組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01），CAE給藥對血糖沒有影響。從表2可見C57糖尿病造模小鼠體重明顯低于正常小鼠（P < 0.01），CAE給藥對體重增加沒有影響。從血糖和體重結果可以看出糖尿病造模成功，同時CAE未見對糖尿病狀態有影響。

2.2 CAE對DR小鼠視網膜組織BRB破壞的影響

由圖1和表3可見，與正常組相比，模型組小鼠視網膜組織Albumin滲漏和VEGFA蛋白表達均增加（P < 0.01），而CAE 100 mg/kg能夠抑制DR小鼠視網膜組織增加的Albumin滲漏和VEGF蛋白表達（P < 0.01）。

2.3 CAE對DR小鼠視網膜組織緊密連接蛋白的影響

由圖2和表4可見，與正常組相比，模型組小鼠視網膜組織Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表達均降低（P < 0.01），而CAE能夠上調DR小鼠視網膜Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達（P < 0.05或P < 0.01），但對ZO-1未有影響（P > 0.05）。

2.4 CAE對DR小鼠視網膜組織NFкB信號通路的影響

由圖3和表5可見，與正常組相比，模型組小鼠視網膜炎性通路p-NFкB、p-IKK蛋白表達增加，IкB蛋白表達降低（P < 0.01），說明DR模型小鼠NFкB通路激活，而給予CAE后可以抑制上述過程（P < 0.01）。

2.5 CAE對DR小鼠血清中炎癥細胞因子水平的影響

由表6可見，DM小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量同正常組小鼠相比顯著增加（P < 0.01），而CAE可以降低DM小鼠炎癥因子的含量（P < 0.01）。

3 討論

DR早期NPDR階段的顯著標志是BRB的破壞和血管滲漏增加，BRB在調節血管通透性、神經-視網膜組織營養物質輸送和供氧中有重要作用[4-6]。Albumin是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40%～60%，細胞外液中僅有極微量的存在。VEGF在促進血管新生和血管通透性方面均有十分重要的作用[7-10]。本研究通過檢測視網膜組織Albumin滲漏和VEGF表達水平反映BRB的破壞情況。結果顯示，CAE均能夠減少DR小鼠視網膜組織增加的Albumin滲漏和VEGF表達，說明CAE具有保護DR小鼠視網膜BRB的藥效活性。

血管內皮細胞間存在的緊密連接蛋白在調節血管內皮細胞間通透性、維持BRB完整性中發揮重要作用[11-13]。已有報道顯示，Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1在DR中表達降低[14-15]。本研究結果顯示，CAE能夠逆轉DR小鼠視網膜組織減少的Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達，而對ZO-1未有明顯影響。結果說明CAE可能通過保護Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達進而保護DR小鼠視網膜BRB。

已有研究認為在糖尿病狀態下，許多炎癥因子水平升高，參與了BRB的炎性破壞[16-17]。NFкB信號通路是經典的炎癥通路，調控許多炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放[18-20]。本研究結果顯示，CAE能夠抑制DR小鼠NFкB信號通路的激活，同時降低DR小鼠血清中增加的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結果提示，CAE能夠抑制DR小鼠炎癥信號通路的激活和炎癥因子的釋放。

綜上所述，本研究發現CAE具有改善STZ誘導小鼠DR的藥效活性，其機制為CAE通過抑制DR小鼠炎癥水平，增加視網膜組織緊密連接蛋白表達，保護視網膜BRB，進而發揮改善小鼠DR的藥效活性。本研究結果提示CAE有望成為治療DR的潛在有效藥物。

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