郭樹鵬++++++楊進(jìn)花++++++趙輝++++++余增洋

[摘要] 目的 觀察青葙子提取物（CAE）對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的C57小鼠糖尿病視網(wǎng)膜病（DR）血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）的改善作用，并進(jìn)一步研究其可能機制。 方法 采用STZ誘導(dǎo)C57小鼠建立DR模型，然后給予DR小鼠CAE 100 mg/kg干預(yù)；通過檢測視網(wǎng)膜組織白蛋白（Albumin）滲漏和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)觀察CAE對DR小鼠BRB破壞的影響；采用Western blot檢測視網(wǎng)膜組織Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1及p-NFκB、IκB、p-IKK的蛋白表達(dá)水平；采用ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。 結(jié)果 CAE能夠逆轉(zhuǎn)DR小鼠視網(wǎng)膜組織Albumin滲漏增加和VEGF表達(dá)的升高（P < 0.01）；CAE能夠上調(diào)DR小鼠視網(wǎng)膜組織降低的緊密連接蛋白Claudin-1、Claudin-5、Occludin表達(dá)（P < 0.05或P < 0.01），同時能夠抑制NFκB信號通路的激活（P < 0.01），并下調(diào)DR小鼠血清中增加的IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P < 0.01）。 結(jié)論 CAE具有保護(hù)STZ誘導(dǎo)DR小鼠BRB的活性，其機制為保護(hù)DR中減少的緊密連接蛋白表達(dá)，同時抑制了DR中炎性信號通路的激活。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病視網(wǎng)膜??；青葙子；血-視網(wǎng)膜屏障；緊密連接蛋白；炎性信號

[中圖分類號] R774.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the amelioration of Celosia argentea L. extract （CAE） on the blood-retina barrier （BRB） of streptozotocin （STZ）-induced diabetic retinopathy （DR）， and to study its possible mechanism. Methods DR was induced by STZ injection in C57 mice and then the DR mice were given with 100 mg/kg CAE. The BRB breakdown was evaluated by the expression of Albumin leakage and VEGF. The levles of Claudin-1， Claudin-5， Occludin， ZO-1， p-NFкB， IκB and p-IKK were detected by Western blot. The levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum were quanlified by ELISA. Results The increased retinal Albumin leakage and VEGF expression were reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. The reduced retinal tight junction protein expressions of Claudin-1， Claudin-5 and Occludin were enhanced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.05 or P < 0.01）. The activation of NFкB signal pathway was inhibited by CAE and further the increased serum TNF-α， IL-1β and IL-6 amount was reduced by CAE in STZ-induced DR mice （P < 0.01）. Conclusion CAE ameliorates DR via improving BRB breakdown by attenuating inflammation and enhancing the retinal tight junction protein expression.

[Key words] Diabetic retinopathy； Celosia argentea L.； Blood-retina barrie； Tight junction protein； Inflammatory signal

糖尿病視網(wǎng)膜病（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，已日漸成為影響成年人視力健康的最主要疾病。臨床上根據(jù)DR的發(fā)病進(jìn)展，分為早期的非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜?。╪on-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和后期的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜?。╬roliferative diabetic retinopathy，PDR）[1]。早期NPDR階段的顯著標(biāo)志是血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破壞和滲出增加，造成缺血缺氧狀態(tài)，若得不到緩解，將進(jìn)展到后期的PDR階段，出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管病理性增生，導(dǎo)致視力嚴(yán)重?fù)p害甚至失明[2-3]。

青葙子是傳統(tǒng)明目中藥，具有清熱瀉火、明目退翳的功效，臨床上常用于治療肝熱目赤、眼生翳膜、視物昏花等。本研究在建立小鼠早期NPDR模型基礎(chǔ)上，觀察了青葙子提取物（Celosia argentea L. extract，CAE）對BRB破壞的保護(hù)作用，進(jìn)一步從CAE對NPDR小鼠緊密連接蛋白表達(dá)和炎癥信號通路的影響兩方面探討了CAE保護(hù)BRB的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

青葙子（Celosia argentea L.），經(jīng)上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科熊波中藥師鑒定為莧科青葙屬青葙的干燥成熟種子。將青葙子藥材于60℃干燥12 h，粉碎后過40目篩，稱取50 g加入500 mL稀乙醇室溫條件浸漬24 h，時時搖動，抽提2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮除去溶劑，得到提取物浸膏。稱取適量浸膏，加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）研磨溶解，配成給藥溶液。

1.2 動物

SPF級健康雄性C57小鼠，5周齡，體重18～22 g，購自中科院上海實驗動物中心。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院吳涇分院實驗動物中心，12 h光暗循環(huán)，飼料與水消毒后自由攝取，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉、多聚甲醛均購自國藥試劑；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA Kits均購自RapidBio公司；BCA Protein Assay Kit購自Thermo Scientific公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液購自Millipore公司；本實驗所用抗體均購自CST公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物實驗 稱取適量STZ粉末避光溶解于緩沖液中，在1 h內(nèi)立即給予已禁食過夜的小鼠腹腔注射，終劑量為55 mg/kg。連續(xù)5 d腹腔注射造模。正常小鼠給予相同體積緩沖液做為對照。末次造模1周后尾靜脈采血測血糖，血糖值高于16.7 mmol/L被認(rèn)為糖尿病造模成功，然后隨機分為兩組：模型組和CAE組。CAE組小鼠2個月后開始予CAE灌胃給藥，最終給藥劑量為100 mg/kg，連續(xù)給藥30 d。每月監(jiān)測血糖和體重。給藥結(jié)束后用烏拉坦麻醉小鼠，腹主動脈取血，立即摘取眼球，用于后續(xù)實驗。

1.4.2 小鼠視網(wǎng)膜組織Albumin滲漏檢測 小鼠左心室盥洗生理鹽水（37℃）以徹底清除體循環(huán)中血液，然后摘取雙側(cè)眼球進(jìn)行Albumin滲漏檢測。

1.4.3 Western blot檢測視網(wǎng)膜組織相關(guān)蛋白表達(dá) 摘取小鼠眼球，于解剖顯微鏡下取出視網(wǎng)膜組織，加入lysis buffer于冰上超聲勻漿，勻漿液用低溫離心機（型號：5810R，Eppendorf公司）以10 000 r/min離心10 min，取出上清，蛋白定量，上樣，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗于4℃慢搖孵育過夜，用1×TBST洗3次后，與二抗室溫慢搖孵育1 h，用1×TBST洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1 min，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.4 小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子檢測 取小鼠血漿以2000 r/min離心10 min，移取上清即得血清，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按照試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重及血糖水平比較

由表1可見，C57糖尿病造模小鼠從第13天開始血糖值均高于16.7 mmol/L且維持穩(wěn)定，與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），CAE給藥對血糖沒有影響。從表2可見C57糖尿病造模小鼠體重明顯低于正常小鼠（P < 0.01），CAE給藥對體重增加沒有影響。從血糖和體重結(jié)果可以看出糖尿病造模成功，同時CAE未見對糖尿病狀態(tài)有影響。

2.2 CAE對DR小鼠視網(wǎng)膜組織BRB破壞的影響

由圖1和表3可見，與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織Albumin滲漏和VEGFA蛋白表達(dá)均增加（P < 0.01），而CAE 100 mg/kg能夠抑制DR小鼠視網(wǎng)膜組織增加的Albumin滲漏和VEGF蛋白表達(dá)（P < 0.01）。

2.3 CAE對DR小鼠視網(wǎng)膜組織緊密連接蛋白的影響

由圖2和表4可見，與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)均降低（P < 0.01），而CAE能夠上調(diào)DR小鼠視網(wǎng)膜Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白的表達(dá)（P < 0.05或P < 0.01），但對ZO-1未有影響（P > 0.05）。

2.4 CAE對DR小鼠視網(wǎng)膜組織NFкB信號通路的影響

由圖3和表5可見，與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜炎性通路p-NFкB、p-IKK蛋白表達(dá)增加，IкB蛋白表達(dá)降低（P < 0.01），說明DR模型小鼠NFкB通路激活，而給予CAE后可以抑制上述過程（P < 0.01）。

2.5 CAE對DR小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平的影響

由表6可見，DM小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量同正常組小鼠相比顯著增加（P < 0.01），而CAE可以降低DM小鼠炎癥因子的含量（P < 0.01）。

3 討論

DR早期NPDR階段的顯著標(biāo)志是BRB的破壞和血管滲漏增加，BRB在調(diào)節(jié)血管通透性、神經(jīng)-視網(wǎng)膜組織營養(yǎng)物質(zhì)輸送和供氧中有重要作用[4-6]。Albumin是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的40%～60%，細(xì)胞外液中僅有極微量的存在。VEGF在促進(jìn)血管新生和血管通透性方面均有十分重要的作用[7-10]。本研究通過檢測視網(wǎng)膜組織Albumin滲漏和VEGF表達(dá)水平反映BRB的破壞情況。結(jié)果顯示，CAE均能夠減少DR小鼠視網(wǎng)膜組織增加的Albumin滲漏和VEGF表達(dá)，說明CAE具有保護(hù)DR小鼠視網(wǎng)膜BRB的藥效活性。

血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在的緊密連接蛋白在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞間通透性、維持BRB完整性中發(fā)揮重要作用[11-13]。已有報道顯示，Claudin-1、Claudin-5、Occludin、ZO-1在DR中表達(dá)降低[14-15]。本研究結(jié)果顯示，CAE能夠逆轉(zhuǎn)DR小鼠視網(wǎng)膜組織減少的Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)，而對ZO-1未有明顯影響。結(jié)果說明CAE可能通過保護(hù)Claudin-1、Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)進(jìn)而保護(hù)DR小鼠視網(wǎng)膜BRB。

已有研究認(rèn)為在糖尿病狀態(tài)下，許多炎癥因子水平升高，參與了BRB的炎性破壞[16-17]。NFкB信號通路是經(jīng)典的炎癥通路，調(diào)控許多炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放[18-20]。本研究結(jié)果顯示，CAE能夠抑制DR小鼠NFкB信號通路的激活，同時降低DR小鼠血清中增加的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結(jié)果提示，CAE能夠抑制DR小鼠炎癥信號通路的激活和炎癥因子的釋放。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CAE具有改善STZ誘導(dǎo)小鼠DR的藥效活性，其機制為CAE通過抑制DR小鼠炎癥水平，增加視網(wǎng)膜組織緊密連接蛋白表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜BRB，進(jìn)而發(fā)揮改善小鼠DR的藥效活性。本研究結(jié)果提示CAE有望成為治療DR的潛在有效藥物。

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