光學干涉斷層成像對球囊損傷聯合高脂喂養兔腹主動脈粥樣硬化模型的認定價值

羅明華++++++王賀++++++司春嬰++++++關懷敏++++++解金紅++++++陳玉善++++++邱承杰++++++董文杰

[摘要] 目的 探索光學干涉斷層成像（OCT）技術在球囊損傷聯合高脂喂養兔腹主動脈粥樣硬化模型中的價值。 方法 20只日本大耳白兔，通過完全隨機化的方法隨機分配至實驗組與對照組，各10只，實驗組采用球囊損傷加高脂喂養8周的方法制作動脈粥樣硬化模型，對照組采用球囊損傷加普通喂養的方法。8周后OCT觀察內膜增殖及管腔狹窄程度，而后病理觀察斑塊性質，考察OCT與病理檢查對粥樣硬化結果的吻合程度。 結果 實驗組飼養后三酰甘油[（1.12±0.42）mmol/L比（0.59±0.35）mmol/L，P < 0.05]、總膽固醇[（12.17±3.14）mmol/L比（1.23±0.25）mmol/L，P < 0.05]、低密度脂蛋白膽固醇[（11.43±3.12）mmol/L比（0.38±0.14）mmol/L，P < 0.05]較基線升高；病理顯示實驗組較對照組管壁更厚，內膜增殖更顯著；OCT發現實驗組管腔面積低于對照組[（4.34±0.22）mm2比（5.13±0.17）mm2，P < 0.01]，新生內膜面積[（2.55±0.19）mm2比（1.66±0.22）mm2，P < 0.01]及平均新生內膜厚度[（94±20）μm比（57±13）μm，P < 0.01]高于對照組，這與病理組織檢查對內膜增殖結果的考察具有良好的一致性。 結論 球囊損傷聯合高脂喂養的方法可以短期內制作出動脈粥樣硬化模型，OCT能夠清晰觀察到兔腹主動脈粥樣硬化模型內膜增殖特點及管腔狹窄程度，可以作為兔動脈粥樣硬化模型成功與否的檢測方法。

[關鍵詞] 光學干涉斷層成像；兔；粥樣硬化；模型；內膜增殖

[中圖分類號] R541.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the value of optical coherence tomography （OCT） for rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis induced by balloon injury and high-fat feeding. Methods Twenty Japanese white rabbits were randomly divided into experimental group and control group by completely randomized method， with 10 rabbits in each group. The experimental group was taken balloon injury and high-fat feeding for 8 weeks to make aortic atherosclerosis models， while the control group was taken the method of balloon injury and normal feeding. After 8 weeks， the conditions of intimal hyperplasia and luminal stenosis were observed by OCT， the plaque characteristic was observed by pathologic examination， the coincided degree of OCT and pathologic examination for the results of aortic atherosclerosis was investigated. Results The levels of triacylglycerol [（1.12±0.42） mmol/L vs （0.59±0.35） mmol/L， P < 0.05]， total cholesterol [（12.17±3.14） mmol/L vs （1.23±0.25） mmol/L， P < 0.05]， low density lipoprotein cholesterin [（11.43±3.12） mmol/L vs （0.38±0.14） mmol/L， P < 0.05] in the experimental group after feeding were significantly increased compared with baseline； the pathologic examination showed that the tube wall of experimental group was thicker than that of control group， the intimal hyperplasia was more significant； OCT showed that， the lumen area of experimental group was lower than that of control group [（4.34±0.22） mm2 vs （5.13±0.17） mm2， P < 0.01]， the neonatal intimal area [（2.55±0.19） mm2 vs （1.66±0.22） mm2， P < 0.01] and average neonatal intimal area [（94±20） μm vs （57±13） μm， P < 0.01] were higher than those of control group， which had good consistency with pathologic examination for intimal hyperplasia. Conclusion The method of balloon injury combined with high-fat feeding can make aortic atherosclerosis models in short time， OCT can observe the characteristics of intimal hyperplasia and the degree of luminal stenosis of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis clearly， which can be used as the method for detecting the success or failure of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis.

[Key words] Optical coherence tomography； Rabbit； Atherosclerosis； Model； Intimal hyperplasia

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心、腦、腎等臟器缺血性疾病的病理基礎，嚴重危害人類健康。建立AS動物模型對研究其病理改變、探索其發病機制具有非常重要的意義。兔是較常采用的實驗動物，高脂喂養或球囊損傷聯合高脂喂養的方法是目前使用較多的造模方法，但是，往往缺乏統一造模成功的標準。有僅僅高脂喂養8周或12周的[1-3]，有兔動脈球囊損傷后高脂喂養8周或16進行造模的[4-5]，亦有先高脂喂養4周，而后球囊損傷造模[6]，有研究采用血管鉗夾技術聯合高脂喂養6周進行造模者[7]，也有研究認為通過高脂喂養4～16周可以制作出不同病理分期的AS模型[8]。因此，適應相應臨床研究需求的兔AS模型的制作仍然有待進一步研究。同樣，兔AS模型成功與否的判斷亦缺乏統一的標準，有研究通過血脂升高判斷是否成功，有通過造影的方法，有研究間接超聲探查頸動脈斑塊判斷[9]，亦有采用核磁共振技術進行檢驗者[10]。但是這些技術各有一定的缺點，血脂升高并不一定形成AS，造影的方法比較可靠，但造影發現狹窄前就已經存在粥樣斑塊，按照造影的標準需要延長模型的飼養時間，增加成本。光學干涉斷層成像（OCT）是一種新型的影像學技術，具有微米級別的分辨率和出色清晰度，可明確AS斑塊特點以及內膜增殖程度[11]。本研究擬建立一種穩定、可靠的兔AS模型，并通過與病理活檢對比的方法，驗證OCT方法在兔AS模型檢測中的價值。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

雄性日本大耳白兔[河南康達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（豫）2011-0001]20只，5月齡，體重2.5～3.0 kg，將兔按照體重依次編號，利用計算機隨機生成兩位數隨機表，以隨意一行開始，將數字與動物編號匹配，與隨機數中的奇數匹配的動物被分至實驗組，余下被分至對照組，實驗組與對照組各10只。實驗組球囊損傷腹主動脈后高脂喂養8周；對照組球囊損傷后普通喂養8周。實驗兔在溫度為22～27℃、濕度為50%的條件下喂養，高脂配方為在普通飼料中加入2%膽固醇、10%豬油和10%蛋黃粉。本研究通過了河南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會的批準并按照動物福利相關規范實施。

1.2 兔腹主動脈粥樣硬化模型的制作

日本大耳白兔（清潔級），預適應飼養1周后，術前3 d予阿司匹林25 mg/d，術前24 h禁食。20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈麻醉，右股動脈剃毛、消毒、鋪巾，鈍性分離右股動脈。直視下穿刺股動脈，置入4F橈動脈鞘管，予以1000 U肝素抗凝。在C形臂X光機下，送入球囊導管至腎動脈以遠腹主動脈，球囊直徑與血管直徑比約為1.2∶1，加壓15～20 atm，緩慢回拉至腹主動脈分叉處，重復3遍，撤出器材，壓迫血管10 min后縫合創口，包扎。術后每天1次肌注青霉素80萬U，共5 d。實驗組術后高脂喂養，對照組普通喂養。8周后OCT檢查與病理檢查。

1.3 血脂檢測

入組時以及球囊損傷后8周空腹時從兔耳中動脈采集血液2 mL，全自動生化儀測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.4 OCT檢查

腹主動脈損傷后8周，采用上述方法麻醉，游離右側股動脈，置入6F橈動脈鞘管，采用OCT儀（Light Lab Image Inc，USA）進行檢查。置入指引導管，送導絲至腎動脈水平以遠，送入成像導管（Image Wire，Light Lab Image Inc，USA）至目標血管。定位后，按照既定的方法[12]進行圖像采集，應用C7X（Light Lab Image，USA）軟件進行OCT圖像分析。所有的圖像資料均由2名經驗豐富的臨床醫師分析。觀察管腔內膜增殖情況，采用每1毫米（10幀圖像）一幀觀察統計，如果圖像質量不佳則前后移動1～2幀，選取最佳者為研究圖像。觀察每個斷層內膜厚度、斑塊面積。

1.5 兔腹主動脈粥樣硬化組織病理檢查

將兔固定于兔臺，剪去腹部被毛，75%乙醇局部皮膚消毒，1%鹽酸利多卡因皮下局麻，沿腹正中線切口約10 cm，分離損傷處腹主動脈，脫水、包埋，切片和HE染色。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組資料比較采用獨立樣本t檢驗，成組資料采用配對t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型制作基本情況

研究納入日本大耳白兔20只，死亡2只。對照組：死亡1只，在進行球囊損傷過程中突發死亡，可能與動脈損傷導致夾層有關。實驗組死亡1只，在球囊損傷后高脂喂養過程中厭食，最終死亡。

2.2 血脂結果

對照組飼養前后TC、TG、LDL-C及HDL-C比較差異無統計學意義（P > 0.05），實驗組飼養后TC、TG、LDL-C水平較基線明顯升高（P < 0.05），實驗組飼養后TC、TG、LDL-C水平顯著高于對照組飼養后，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 病理檢查結果

大體觀，對照組動脈柔軟富有彈性，顏色粉紅，內膜光滑，個別標本可見脂質條紋，無明顯斑塊。實驗組兔腹主動脈粗細不均，血管壁明顯增粗，變硬，顏色黃白相間，肉眼可見管壁明顯增厚，可見融合成片狀的黃白條紋或斑塊隆起于管腔。動脈管壁病變硬化分為5個級別[13]：0級，內膜光滑，無奶油樣變化；1級，有明顯的凸起奶油樣斑塊，面積小于3 mm2；2級，斑塊面積大于3 mm2；3級，斑塊融合成片，大部分斑塊面積大于3 mm2；4級，斑塊幾乎覆蓋整個動脈內膜。本研究中，實驗組集中于2級與3級，而對照組集中于0級與1級。HE染色觀察，對照組9例中僅有2例可觀察到內膜輕微增殖變厚，中層平滑肌存在，其余則未見明顯病理改變；實驗組中9例均可見內膜增殖明顯，管腔內部可見顯著的脂質斑塊存在，內膜下可見大量的泡沫細胞與淋巴細胞聚集，中膜平滑肌增生（圖1）。

2.4 OCT檢查結果

對照組OCT成像顯示內膜較光滑，有一定程度的增殖，無斑塊形成；實驗組內膜增生明顯，斑塊負荷較重，新生內膜厚度更厚（圖2），新生內膜面積顯著高于對照組，平均新生內膜厚度高于對照組，管腔面積小于對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。見表2。

2.5 OCT檢查與病理結果比較

對照組與實驗組腹主動脈管腔內膜最厚處進行病理與OCT檢查結果進行分析，對照組均表現為輕度內膜增殖，實驗組則表現為新生內膜更厚，動脈粥樣斑塊顯著增殖，管腔面積下降明顯。OCT結果與病理解剖結果具有較好的一致性。

3 討論

AS動物模型研究很多，但目前尚無能夠完美復制出精確病理的AS動物模型。兔是制作AS模型的候選動物，它成本低、操作方便，且脂代謝與人類有相似之處。但單純高脂飼養短期內難以造出AS模型，且易生病，導致動物死亡。報道稱單純高脂喂養需要3～4個月的時間才能造成兔AS模型[14]。因而，往往采取球囊損傷聯合高脂喂養的方式[5-6]造模。本研究即采取該方式進行造模，結果顯示囊損傷聯合高脂喂養8周，大體標本可以看到2、3級的動脈硬化，光鏡可以看到所有動物表現為內膜增殖、顯著脂質斑塊、內膜下泡沫細胞與淋巴細胞聚集、中膜平滑肌增生等病理改變，提示該方法能夠成功復制出滿足后續實驗需求的AS模型。

目前對AS模型的評價缺乏合適的方法，OCT能夠成功檢測到早期脂質條紋以及斑塊[15]，且比血管造影的敏感性更高[16]。如果通過OCT檢測到動脈內膜增殖、早期斑塊的形成，可以認定AS模型的成功。Tian等[17]使用OCT檢測通過氯化鐵誘導的兔AS模型，顯示了良好的結果。同時發現OCT檢測結果與病理組織檢查具有良好的同一性。Zhang等[18]利用OCT及IVUS觀察兔AS模型的粥樣斑塊，結果發現OCT在對粥樣斑塊厚度及斑塊性質的判斷方面較IVUS具有較高的敏感性及實用價值。本研究通過物理損傷聯合高脂喂養能夠在相對較短的8周時間內制造出AS模型，OCT觀察到內膜不均勻增殖，且與病理結果具有良好的一致性。

AS模型成功后，欲連續觀察斑塊進展以及消退，以往研究往往采取分批處死的方式，而缺乏同一動物動脈同一斑塊連續檢測的影像學數據。那么，通過OCT這一技術則能夠解決這一瓶頸。本研究成功對兔腹主動脈進行侵入性球囊損傷后，再次介入的辦法進行OCT檢查，而且亦可通過其他的動脈入路進行再次的OCT檢查。為此后的研究鋪平了道路。Fulcher等[19]對高脂喂養兔腹主動脈AS模型研究中，采用不同入路對腹主AS靶點成功進行多次OCT圖像采集。研究中，由于球囊損傷范圍較大，可能造成較大范圍與長度的AS改變。為了統一OCT探測范圍以及組織學考察目標，本研究采用了Asml等[20]的研究方法，通過分叉血管作為標志點，在此標志點附近進行球囊損傷與OCT觀察。另外，OCT檢查耗材費用較高，為了節約實驗成本，本研究重復使用了經過消毒的OCT成像導管，從而盡可能降低實驗的成本。

總之，本研究通過球囊損傷聯合高脂喂養的方式，短期內成功復制出兔腹主動脈AS模型，且該模型通過OCT以及病理組織學檢驗，均發現了新生內膜增殖、管腔面積減少等，具有良好的一致性，OCT技術可以作為兔AS模型成功與否的檢測方法。

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