小麥 TcLr19PR2基因在茉莉酸甲酯、乙烯及葉銹菌脅迫下的表達分析

張家瑞，張艷俊，王 菲，王海燕，劉大群

(河北農業大學植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，河北保定 071001)

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小麥 TcLr19PR2基因在茉莉酸甲酯、乙烯及葉銹菌脅迫下的表達分析

張家瑞，張艷俊，王 菲，王海燕，劉大群

(河北農業大學植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，河北保定 071001)

為揭示小麥 TcLr19PR2基因在信號分子和葉銹菌誘導下的表達情況，利用半定量RT-PCR方法分析了不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯(ETH)誘導后于不同時間點該基因表達模式，明確MeJA和ETH最佳誘導濃度及誘導時間，同時分析了MeJA和ETH預處理后于不同時期接種葉銹菌后該基因在小麥中的表達特征。結果表明，MeJA和ETH的最佳誘導濃度分別為0.1和1.0 mmol·L-1。接種葉銹菌后， TcLr19PR2基因表達量在MeJA誘導后0～3 d都有明顯上調，并在MeJA預處理3 d后接種葉銹菌24 h時 TcLr19PR2基因表達量達到最大，基因表達峰值的出現要早于未接菌處理；ETH預處理3 d后接種葉銹菌24 h時 TcLr19PR2基因表達水平開始升高，預處理10 d后，接菌處理的各時間點均高于未接菌處理。以上結果說明，葉銹菌和信號分子協同作用能夠顯著誘導 TcLr19PR2基因的表達，共同參與小麥品系TcLr19的抗葉銹病防御反應。

小麥；葉銹菌；信號分子；β-1,3-葡聚糖酶基因；表達分析

β-1,3-葡聚糖是真菌細胞壁的重要結構成分。許多真菌的菌絲尖端往往直接受到β-1,3-葡聚糖酶的攻擊。β-1,3-葡聚糖酶能催化β-1,3-葡聚糖多聚體水解，水解的寡糖產物是植物防御反應的重要激發子。激發子作為植物-病原菌相互識別的重要信號分子，能誘導植物產生重要防衛反應，可對侵染真菌的菌絲壁直接進行攻擊，從而抑制真菌的生長與增殖，并且催化的水解產物可以作為下游信號分子，進一步誘導防御，從而使植物表現抗病性[1-2]。β-1,3-葡聚糖酶還可以有效調節各種信號分子的脅迫，例如水楊酸(salicylic acid，SA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)和乙烯(ethylene，ETH)[3]。Niu等[4]用茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)處理小麥幼苗葉片后，通過離體葉段培養法接種白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici,Bgt)進行抗性鑒定，并用實時定量PCR技術檢測葉片中β-1,3-葡聚糖苷酶基因的表達量變化，結果表明，白粉菌對β-1,3-葡聚糖苷酶的誘導作用可達10～70倍，β-1,3-葡聚糖苷酶基因的表達明顯增強。傅俊范等[5]用MeJA處理人參后接種銹腐菌發現，人參根系β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶的活性均較對照增強，表明β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶在MeJA誘導人參抗人參銹腐病的過程中起重要作用。

正常情況下，β-1,3-葡聚糖酶在植物體內表達很少。植物在病原真菌入侵后，β-1,3-葡聚糖酶防衛蛋白在細胞內積累會有所增加。有研究表明，水稻在紋枯菌侵染24 h后，受感染植株的β-1,3-葡聚糖酶活性較正常植株蛋白活性增強3.9倍[6]，而小麥在被禾谷類鐮刀菌感染后72 h，則完全誘導產生了β-1,3-葡聚糖酶[7]，但這些蛋白往往表達量不夠，或表達期太晚，或由于病原真菌分泌蛋白對內源 β-1,3-葡聚糖酶的抑制等，以致不能使植物體免受病害。所以現在經常將外源β-1,3-葡聚糖酶基因導入植物，可提高植物對病原菌的抗性。超表達β-1,3-葡聚糖酶增強了植株抵御真菌病害的能力。劉桂珍等[8]通過激光微束穿刺法將含有β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶基因的雙價載體pLGC導入棉花幼胚，進而選育出對黃萎病具有較高抗性的轉基因棉花株系。目前，已從青花菜[9]、指天蕉[10]、棉花[11]、荔枝[12]、毛竹[13]和甘蔗[14]等植物中分離到β-1,3-葡聚糖酶基因。在小麥與根腐菌[15]和條銹菌[16]互作中也有相關的報道。

小麥品系TcLr19攜帶抗葉銹病基因 Lr19，該基因是一個全生育期抗性基因，對全國大部分生理小種均有很好的抗性，具有良好的開發應用前景。本實驗室前期采用RT-PCR方法在TcLr19中獲得1個β-1,3-葡聚糖酶基因，命名為 TcLr19PR2，并利用半定量RT-PCR分析該基因在葉銹菌誘導不同時間后的轉錄情況，初步明確了該基因表達明顯受小麥葉銹菌誘導，同時構建了 TcLr19PR2基因的原核表達載體pEASY- PR2并獲得一個分子量約為30 kDa的融合蛋白。本研究擬利用半定量RT-PCR方法分析不同濃度MeJA和ETH誘導后于不同時間點該基因表達模式，明確MeJA和ETH最佳誘導濃度及誘導時間，同時分析了MeJA和ETH預處理后于不同時期接種葉銹菌后該基因在小麥中的表達特征，為揭示 TcLr19PR2基因在信號分子和葉銹菌誘導下的表達模式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試小麥材料為以Thatcher為遺傳背景的攜帶小麥抗葉銹病基因 Lr19的回交6代近等基因系材料TcLr19，供試小麥葉銹菌菌株為07-10-421-3(FHJT)，與TcLr19為非親和組合(侵染型為“;”)，均由河北農業大學小麥銹病研究室收集保存。

1.2 材料的處理及取樣

參考張艷俊等[17]及Zambounis等[18]的方法分別配置0.01、0.05、0.1和1.0 mmol·L-1四種不同濃度的ETH和MeJA溶液，于一心一葉期，噴灑小麥葉片表面至溶液滴下，溫室內培養。分別于噴施后0、6、12、24、48、72、96、120 h時，剪取葉片0.1 g，液氮速凍，于-80 ℃條件下保存，以備用于篩選最佳誘導濃度。

以上述篩選到的最佳誘導濃度的MeJA和ETH分別處理小麥葉片0、1、3、5和10 d后，采用撒粉法接種葉銹菌07-10-421-3(孢子萌發率為80%以上)，同時設不接菌及清水對照；在小麥葉片上噴水霧后，置黑暗條件下保濕14～16 h，然后轉入溫度為18～25 ℃、光照時間為10～14 h的溫室培養。分別于接種后0、24、48、72、96和120 h時取葉片0.1 g，液氮速凍，-80 ℃條件下保存，以備用于分析 TcLr19PR2基因在MeJA和ETH脅迫及接菌誘導情況下的表達模式。

1.3 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

采用Bio-Flux公司的BIOZOL提取小麥各處理樣品總RNA，按照寶生物工程大連有限公司的反轉錄酶試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.4 小麥 TcLr19PR2基因的表達分析

根據前期獲得的 TcLr19PR2基因全長序列，設計特異引物qTcLr19PR2-F/qTcLr19PR2-R(qTcLr19PR2-F: 5′-CAACGAGAACCAGAAG GACAGC-3′; qTcLr19PR2-R: 5′-TACGGACG GACATACGGACACT-3′)進行半定量RT-PCR分析。其中，內標為小麥中組成型表達基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH，GenBank登錄號：AF251217)，其特異性引物為GAPDH-F/GAPDH-R(GAPDH-F: 5′-AACTGCCTTGC TCCTCTTGC-3′; GAPDH-R: 5′-CTGTTGTC ACCCTGGAAGTCA-3′)。以小麥葉銹菌誘導后的TcLr19小麥cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：100 ng模板cDNA，10 μmol·L-1引物1 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.3 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，加入滅菌ddH2O至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，通過genetools軟件得出表達量大小，利用SPSS軟件進行方差和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度MeJA誘導 TcLr19PR2基因的表達分析

不同濃度MeJA處理小麥葉片后，與對照(0 h)相比，小麥 TcLr19PR2基因的表達量在各時間點變化明顯(圖1)。0.01 mmol·L-1MeJA脅迫處理后，在120 h時出現表達高峰；0.05 mmol·L-1MeJA脅迫處理后，各時間點的表達量均低于0 h；0.1 mmol·L-1MeJA脅迫處理后，在6 h時表達量顯著上調并達到最大；1.0 mmol·L-1MeJA脅迫處理后，48 h時表達量有上調并達到最大。雖然0.01、0.1和1.0 mmol·L-1MeJA脅迫處理后 TcLr19PR2基因的表達出現高峰時表達量相近，但0.1 mmol·L-1MeJA脅迫處理出現高峰的時間明顯早于0.01 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1MeJA脅迫處理，綜合表達高峰出現時間的早晚及表達量的高低最終明確0.1 mmol·L-1MeJA為 TcLr19PR2基因的最佳誘導濃度。

*和**分別表示與對照差異在0.05和0.01水平上顯著。下同。

* and ** indicate significant difference between reagent treament and CK at 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as below.

圖1 不同濃度MeJA處理下 TcLr19PR2基因的相對表達量

Fig.1 Expression levels of TcLr19PR2 gene induced by different concentrations of MeJA

2.2 不同濃度ETH誘導 TcLr19PR2基因的表達分析

不同濃度ETH處理小麥葉片后，與對照(0 h)相比，小麥 TcLr19PR2基因的表達量在各時間點同樣變化明顯(圖2)。0.01 mmol·L-1ETH脅迫處理后， TcLr19PR2基因的表達量在48 h時有所上調，其余各時間點均低于0 h；0.05 mmol·L-1ETH脅迫處理后， TcLr19PR2基因的表達量在各時間點均低于0 h；0.1 mmol·L-1ETH脅迫處理后， TcLr19PR2基因的表達量6 h顯著上調并達到最大；1.0 mmol·L-1ETH脅迫處理后，在24 h時其表達量急劇上升并達到最大值。雖然0.1 mmol·L-1ETH脅迫處理后 TcLr19PR2基因的表達出現高峰時間要明顯早于1.0 mmol·L-1ETH脅迫處理，但表達量要低于1.0 mmol·L-1ETH脅迫處理。綜合表達高峰出現時間及表達量結果，1.0 mmol·L-1ETH為 TcLr19PR2基因的最佳誘導濃度。

圖2 不同濃度ETH處理下 TcLr19PR2基因的相對表達量

2.3 MeJA脅迫處理后不同時期接菌誘導 TcLr19PR2基因的表達分析

0.1 mmol·L-1MeJA脅迫處理0、1、3、5和10 d后清水對照與僅用MeJA脅迫處理相同時間后 TcLr19PR2基因表達趨勢基本一致，無明顯差異。而用0.1 mmol·L-1MeJA脅迫處理后再接種葉銹菌， TcLr19PR2基因的表達量在各時間點有所變化，以0～3 d上調較為明顯，并在第3天24 h時達到最大，約為對照(0 h)的4倍(圖3)。此外，MeJA脅迫處理3～10 d后接種葉銹菌， TcLr19PR2基因表達量有所降低，雖在脅迫處理5 d和10 d后接種葉銹菌，該基因分別在120 h和0 h出現了兩個表達高峰，但均不高于第3天24 h時的表達量。因此，MeJA預處理后再接種葉銹菌在各時間點均會有基因的表達，但以MeJA預處理后3 d接種葉銹菌 TcLr19PR2基因表達量最高，表明MeJA預處理后3 d TcLr19PR2基因與葉銹菌協同作用最明顯。

2.4 ETH脅迫處理后不同時期接菌誘導 TcLr19PR2基因的表達分析

1.0 mmol·L-1ETH脅迫處理0、1、3、5、10 d后不同時間點接種清水與僅用ETH脅迫處理相同時間后 TcLr19PR2基因表達趨勢基本一致，并無明顯的變化。而用1.0 mmol·L-1ETH脅迫處理后再接種葉銹菌， 結果表明，0～1 d時 TcLr19PR2基因表達量變化較大，與兩種未接菌處理相比雖然個別時間點表達量有所升高，但都不高于第1天的0 h時未接菌組的表達量，隨后在3～5 d基因表達量從第3天24 h開始高于未接菌處理，雖然在第5天的0 h及24 h表達有所降低，但整體水平還是高于未接菌處理的，到第10天， TcLr19PR2基因表達量在各時間點明顯都高于未接菌處理，其中以96 h表達量為最大(圖 4)。總體來說，用ETH預處理后再接種葉銹菌， TcLr19PR2基因在各時間點均會有所表達，只是基因的高表達均出現在后期，分析前期可能主要參與其他信號通路。總之，ETH與葉銹菌共同作用可以誘導 TcLr19PR2基因的表達。

3 討 論

大量的研究表明，病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins，PR)基因在植物后期的防衛反應中發揮著重要的作用，當植物受到外界不良環境條件刺激時，植物體內化學分子的含量會增加。其中β-1,3-葡聚糖酶是一類重要的病程相關蛋白(PR2)，通常以基因家族形式存在。β-1,3-葡聚糖酶不僅能直接作用于病原菌細胞壁，而且其作用的產物(低聚糖)可作為誘導物誘導與其他抗病反應有關的酶系，由此促進了植保素、木質素等抗病物質的合成與積累，進而增強植物的抗病性[19-20]。孫 斌等[21]從小麥葉片中提取的β-1,3-葡聚糖酶對小麥紋枯病和煙草赤星病均具有抑制作用。此外，植物的β-1,3-葡聚糖酶活性可以由病原菌的感染而增強，也能被一些誘導物所誘導。

A～E表示小麥葉片經0.1 mmol·L-1MeJA分別預處理0、1、3、5和10 d。

A-E indicate wheat leaves treated with 0.1 mmol·L-1MeJA for 0, 1, 3, 5 and 10 d, respectively.

圖3 0.1 mmol·L-1MeJA及接菌處理下 TcLr19PR2基因的相對表達量

Fig.3 Expression level of TcLr19PR2 under 0.1 mmol·L-1MeJA andP.triticina

MeJA作為一種信號分子，可以參與植物對病原菌的應答反應和信號傳遞，從而誘導植物的抗病反應[22]。賓金華等[23]報道，MeJA處理煙草幼苗可以提高幼苗抗炭疽病的能力。張智慧等[24]研究表明，MeJA處理水稻后提高了水稻幼苗的抗瘟性。本研究明確 TcLr19PR2基因明顯受MeJA的誘導，外源噴施0.1 mmol·L-1的MeJA后再接種葉銹菌， TcLr19PR2基因表達量在特定時間點會有所上調，整體表達水平相對高于未接菌的處理組。其次發現接菌處理后， TcLr19PR2基因的表達量有一個從低到高繼而又有所下降的趨勢，原因可能是MeJA誘導抗病效果有一定的時間持續性，一定濃度的MeJA 誘導一定時間后激發相關防衛基因表達水平達到峰值，抗病效果最佳，隨后植株體內MeJA 逐漸被消耗，誘導的防衛基因表達下降，抗病性有所降低[25-26]，這與向妙蓮等[27]的研究結果相一致。ETH在植物的抗病反應中是植物防御反應的報警信號物質，同時參與防御反應。有研究表明，植物在受病原菌侵染后，ETH的積累量會明顯增加，并且可誘導激活包括葡聚糖酶(PR-2)、幾丁質酶(PR-3)和抗菌肽以及滲透調節蛋白(osmotin)在內的PR的表達和積累。ETH的信號轉導既能參與R基因抗病反應，又能激發活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的積累，同時也能引起感病組織的PCD(programmed cell death)[28]。Lund等[29]將番茄細菌性葉斑病原菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)接種在番茄幼苗上，發現ETH合成量有所增加，高峰持續時間也長，并且ETH合成時間與病斑形成時間一致，這表明ETH在番茄應答病害反應中與病斑的形成是有聯系的。此外，SA、JA(jasmonic acid)和ETH都參與植物對病原菌侵染和外界傷害的應答反應，它們的信號途徑之間存在著交叉，但SA主要誘導酸性PR基因的表達，而JA和ETH主要誘導堿性PR基因的表達。當植物受到病原菌侵染時，能夠同時觸發ETH和JA這兩種信號途徑，二者共同促進植物應答傷病的防衛基因的表達。在本研究中，用不同濃度ETH脅迫處理后發現， TcLr19PR2基因表達量是有差異的，從中篩選得到最佳誘導濃度1.0 mmol·L-1。在利用最佳濃度的ETH脅迫處理植株后接種葉銹菌，發現 TcLr19PR2基因表達量在不同時間點有所不同，但從第3天開始有所增高，到第10天時則明顯高于ETH誘導處理。在第3天至第10天期間， TcLr19PR2基因表達量雖有所升高，但是總體來說上升幅度不算太大，且在某個時間點時會出現下降，但在第10天時，總體水平都較高，最大水平時約是對照的6倍，原因可能是在植株生長前期有其他信號途徑在起主要作用，而ETH的作用相對出現滯后。

A～E表示小麥葉片經1.0 mmol·L-1ETH分別預處理0、1、3、5和10 d。

A-E indicate wheat leaves treated with 1.0 mmol·L-1ETH for 0, 1, 3, 5 and 10 d, respectively.

圖4 1.0 mmol·L-1ETH及接菌處理下 TcLr19PR2的相對表達量

Fig.4 Expression level of TcLr19PR2 under 1.0 mmol·L-1of ETH andP.triticina

綜上所述，經不同濃度的MeJA和ETH脅迫處理后接種葉銹菌，小麥中β-1,3-葡聚糖酶的活性在不同時間點均會出現表達高峰。而且，MeJA處理后接種葉銹菌，β-1,3-葡聚糖酶活性高峰在0 d即出現，并在第3天達到最大，而單獨用MeJA處理酶活性高峰則出現晚，說明MeJA與葉銹菌協同而作用可更快誘導小麥中β-1,3-葡聚糖酶的表達。另外，用ETH脅迫處理后接種葉銹菌，β-1,3-葡聚糖酶活性在第5天有所增加，到第10天各時間點均高于前兩種處理，說明ETH和MeJA可能存在協同作用，兩者在病原菌侵染前后期均可發揮作用。

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Expression Analysis of TcLr19PR2 Gene in Wheat TcLr19 Induced by MeJA, ETH andPucciniatriticina

ZHANG Jiarui，ZHANG Yanjun，WANG Fei，WANG Haiyan，LIU Daqun

(College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei/Biological Control Center of Plant Disease and Plant Pests of Hebei Province,Baoding,Hebei 071000, China)

In order to identify the expression profiles of a full length β-1,3-glucanase gene, TcLr19PR2, induced by different chemical molecule and leaf rust pathogen, the gene expression levels of TcLr19PR2 induced by the optimal concentrations Methyl jasmonate(MeJA) and Ethylene(ETH) were analysed using semi-quantitative RT-PCR with TcLr19 as experiment material. These results suggested that the optimal concentrations were 0.1 mmol·L-1for MeJA and 1.0 mmol·L-1for ETH, respectively. MeJA pre-treatment prior to infection resulted in a steady increase in TaLr19PR2 expression from 0 to 3 days post inoculation(dpi), and reached the peak at 24 hour post inoculation(hpi), which appeared earlier than that in the Mock(non-inoculation). The expression level of TcLr19PR2 increased at 24 hpi after ETH pre-treatment prior to infection, and higer than that in Mock at 10 dpi after ETH pre-treatment prior to infection. All these results proved that the expression of TcLr19PR2 was induced byP.triticinaand signaling molecules together, which might be involved in the defense reaction toP.triticinaof TcLr19.

Wheat; Leaf rust pathogen; Signal molecule; β-1,3-glucanase gene; Expression analysis

時間：2016-10-08

2016-03-25

2016-09-09

河北省自然科學基金項目(C2012204005)；國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2013CB127700)

E-mail: angelzhangjiarui@163.com(張家瑞)；zyj18730222136@163.com(張艷俊，與第一作者同等貢獻)

王海燕(E-mail: ndwanghaiyan@163.com)；劉大群(E-mail: ldq@mail.hebau.edu.cn)

S512.1；S332.2

A

1009-1041(2016)10-1299-08

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.008.html