MTHFR和MTRR的SNP多態性與漢族孕婦復發性流產的相關性分析

王開林

(昆山市第四人民醫院婦產科，江蘇 昆山 215331)

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MTHFR和MTRR的SNP多態性與漢族孕婦復發性流產的相關性分析

王開林

(昆山市第四人民醫院婦產科，江蘇 昆山 215331)

目的 探究MTHFR和MTRR的SNP多態性與漢族孕婦復發性流產的相關性。方法 選取2012年1月至2015年2月無明確原因復發性流產而至昆山市第四人民醫院婦產科就診的非妊娠婦女190例歸為觀察組，另外選取同時間段進行體檢的健康非妊娠婦女180例為對照組，比較兩組婦女MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G基因位點的單核苷酸多態性(SNP)。結果 觀察組婦女MTHFR基因C677TT等位基因分布頻率為32.11%，對照組為21.94%，觀察組顯著高于對照組(χ2=9.647，P=0.002)。觀察組婦女MTHFR基因A1298C等位基因分布頻率為34.47%，對照組為30.83%，兩組比較無顯著性差異(χ2=1.113，P=0.291)。觀察組婦女MTRR基因A66GG等位基因分布頻率為32.37%，對照組為15.28%，觀察組顯著高于對照組(χ2=29.558，P=0.000)。結論 MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點的多態性與復發性流產密切相關。

MTHFR；MTRR；SNP；漢族孕婦；復發性流產；相關性

美國生殖醫學會將復發性流產定義為孕20周前出現2次及以上的流產，引發復發性流產的因素較多，主要包括生殖器官畸形、染色體異常、內分泌及免疫功能紊亂、遺傳因素、營養不良和環境因素等，還有約45%的復發性流產的原因尚不明確，醫學上稱為不明原因復發性流產[1]。有研究發現妊娠結局與孕婦體內葉酸含量關系密切，體內葉酸水平較低可增加子癇前期、胎盤早剝、神經管畸形及復發性流暢等疾病的風險，而亞甲基四氫葉酸還原酶基因(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)及甲硫氨酸合成還原酶基因(methyltransferase reductase，MTRR)是葉酸代謝的關鍵酶，而且這兩種酶在不同國家地區及不同民族中呈多態性分布[2]。我國對此相關研究較少，故本研究深入探討了MTHFR和MTRR的基因多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與漢族孕婦復發性流產的相關性，以期為臨床診治復發性流暢提供新的思路和數據參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月至2015年2月無明確原因復發性流產而至昆山市第四人民醫院婦產科就診的非妊娠婦女190例歸為觀察組，年齡21～40歲，平均年齡(29.8±6.9)歲；另外選取同時間段于昆山市第四人民醫院進行體檢的健康非妊娠婦女180例歸為對照組，年齡21～40歲，平均年齡(29.8±6.9)歲。

1.2病例納入排除標準

1.2.1納入標準

①觀察組需為流產2次或2次以上的婦女，對照組婦女為健康無妊娠史或成功妊娠1次者；②夫妻雙方染色體檢查結果正常或結構正常，且均無復發性流產遺傳史；③輸卵管、子宮影像學檢查生殖器正常；④月經周期、血糖、甲狀腺功能及甲狀腺激素水平等內分泌指標正常；⑤知情同意，并簽署知情同意書。

1.2.2排除標準

①支原體、巨細胞病毒等細菌、病毒感染者；②近期(3個月)內接受過維生素補充治療的婦女；③患有嚴重肝、腎等臟器疾病者；④妊高癥或宮內胎兒死亡病史者；⑤有靜脈血管栓塞史者。

1.3樣本DNA采集

由婦產科醫師采集樣本，應用專業口腔黏膜上皮細胞采樣刷于受檢者口腔內側上下刮拭5余次，注意刮拭力量為略鼓起最佳，用柱式抽提試劑瓶抽提待檢者樣本DNA。

1.4基因檢測

應用Taqman-MGB 技術對MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG基因位點的單核苷酸多態性進行檢查，相關試劑、儀器均購于美國ABI公司，Taqman Uneiversal Master Mix貨號4326701。熒光定量PCR反應用于MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG的定量測定。各個反應體系總體積為10μL，包括2×Taqman Uneiversal Master Mix 5μL，20ng/μL的DNA模板1μL，去離子水3.5μL，20×Taqman-MGB 探針0.5μL。以10min 95℃為反應條件，進行20個循環擴增(15s，92℃；1min，60℃)，隨后30個循環擴增(15s，80℃；90s，60℃)，反應結束于4℃條件下保存。在熒光定量PCR儀(型號ABI700)上讀取樣品孔終點熒光，分析各樣本基因分型結果。

1.5統計學方法

所有數據經雙人錄入后，采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理。計數資料采用例或百分率表示，計量資料采用均數±標準差表示。兩組年齡的比較采用t檢驗進行分析，兩組各位點基因頻率的比較采用卡方檢驗進行統計學處理，P<0.05記為差異具有統計學意義。

2結果

2.1兩組婦女亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T位點基因頻率比較

觀察組婦女MTHFR的C677TT基因頻率(15.26%)明顯高于對照組婦女(1.11%)，差異具有統計學意義(P=0.000)；觀察組婦女MTHFR的C677TT等位基因分布頻率(32.11%)明顯高于對照組(21.94%)，差異具有統計學意義(P=0.002)，見表1。

表1 兩組婦女MTHFR基因C677T位點基因頻率比較[n(%)]

2.2兩組婦女甲基四氫葉酸還原酶基因A1298C位點基因頻率比較

觀察組婦女MTHFR的A1298C基因分布頻率與等位基因分布頻率和對照組之間均無統計學差異(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組婦女MTHFR基因A1298C位點基因頻率比較[n(%)]

2.3兩組婦女甲硫氨酸合成還原酶基因A66GG位點基因頻率比較

觀察組婦女MTRR的A66GG基因頻率(12.11%)明顯高于對照組婦女(4.44%)，差異具有統計學意義(P=0.008)；觀察組婦女MTRR的A66GG等位基因分布頻率(32.37%)明顯高于對照組(15.28%)，差異具有統計學意義(P=0.000)，見表3。

表3 兩組婦女MTRR基因A66GG位點基因頻率比較 [n(%)]

3討論

3.1復發性流產發病與凝血機制的關系

現階段復發性流產發病與凝血機制的研究關注度日趨升高，凝血機制變化因素主要分為遺傳性凝血及獲得性凝血。李秀娟[3]的研究發現遺傳性凝血機制與基因的多態性存在關聯性，葉酸的關鍵酶MTHFR及MTRR可通過影響葉酸的代謝而使血液發生高凝。MTHFR可催化亞甲基四氫葉酸生成N5-甲基四氫葉酸參與到嘌呤及胸腺嘧啶的合成過程中，進而影響DNA的修復合成[4]。此外，N5、N10亞甲基四氫葉酸形成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)，而SAM為重要的甲基供體，與甲硫氨酸代謝過程中的半胱氨酸(homocysteine，Hcy)關系密切[5]。MTHFR及MTRR出現基因突變后可改變酶的熱穩定性及活性，進而影響葉酸的代謝及合成，降低機體N5-甲基四氫葉酸水平，造成SAM及甲硫氨酸的合成障礙，DNA的甲基轉移酶活性下降可造成S-腺苷同型半胱氨酸及Hcy沉積，引發高同型半胱氨酸血癥，而高同型半胱氨酸血癥可影響DNA的甲基化水平及合成、修復，是導致胎兒出生缺陷的獨立危險因素[6]。

3.2基因多態性的作用機制

MTHFR及MTRR呈多基因多態性(SNP)分布，其中以MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66GG基因位點的單核苷酸多態性研究最多，據研究顯示上述基因的多態性對血清、紅細胞葉酸濃度及編碼酶活性影響顯著[7]。而我國對上述基因的多態性相關研究較少，故此本研究深入探討了MTHFR和MTRR的SNP多態性與漢族孕婦復發性流產的相關性，以期為臨床診治復發性流暢提供新的思路和數據參考。

有研究報道：MTHFR C677T突變可能是早期妊娠丟失的遺傳易感性因素，與CC基因型個體相比，TT基因型的個體發生早期妊娠丟失的風險高達3.596倍[8]。本研究也發現觀察組婦女MTHFR基因C677TT等位基因分布頻率明顯高于對照組婦女，差異具有統計學意義(P<0.01)；觀察組婦女MTHFR基因A1298C等位基因分布頻率與對照組婦女相比無顯著性差別，比較不具有統計學意義(P>0.05)；觀察組婦女MTRR基因A66GG等位基因分布頻率明顯高于對照組婦女，比較具有統計學意義(P<0.01)。上述結果提示MTHFR基因C677TT及MTRR基因A66GG的基因多態性與復發性流產的發生具有相關性。

MTHFR基因長19.2kb，mRNA長7 009bp，位于染色體的1p36.3處。研究發現MTHFR最常見的突變位點是第677位點，常在此區域發生C→T堿基替換，編碼蛋白質可由丙氨酸轉為纈氨酸。此外，經過研究發現第1 298位點也常發現基因突變。MTHFR共含12個外顯子，C6777T處于第5個外顯子，可使Ala轉變為Val，降低MTHFR的酶熱穩定性及活性。較677CC基因型，TT基因型的酶活性可下降20%以上[9]。A1298C處于第8個外顯子，可使Glu轉變為Ala，降低MTHFR的酶熱穩定性及活性。Hou 等[10]的研究發現不明原因復發性流產患者MYHFR的677T的等位基因頻率明顯高于正常組，證實T等位基因是引發不明原因復發性流產的高危因素，與本研究結果相符。 MTRR可催化半胱氨酸轉化為蛋氨酸，是半胱氨酸第66位點的A堿基向G堿基突變，因而編碼蛋白質由蛋氨酸轉變成異亮氨酸，降低了MTRR的酶活性。吳文慶等[11]研究發現,MTRR66發生純合突變成GG基因型的女性血漿中半胱氨酸含量下降但是葉酸含量升高，具體機制尚不明確，人群中MTRR活性cDNA序列的G等位基因頻率為0.53，當女性出現MTHFR突變或鈷胺素水平下降時，可增加不良孕產的危險性。

本文經過研究認為對復發性流產孕婦且葉酸基因出現突變患者，可通過補給大劑量葉酸降低流產率，但最佳劑量的多少及是否可以長期服用還有待進一步研究。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66GG位點的多態性可能是導致復發性流產的原因，這對孕期指導補充劑檢測葉酸，降低復發性流產率具有重要意義。

[1]Mfady D S,Sadiq M F,Khabour O F,etal.Associations of variants in MTHFR and MTRR genes with male infertility in the Jordanian population[J].Gene,2014,536(1):40-44.

[2]李俊華,魯衍強,馬少杰,等.廊坊市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性分析[J].基礎醫學與臨床,2014,34(11):1564-1565.

[3]李秀娟,徐敏,徐梅,等.葉酸利用能力分子醫學檢測在母胎醫學領域的應用[J].中國婦幼健康研究,2014,25(5):895-898.

[4]徐小惠,魯衍強,李瑛,等.湖北省英山縣漢族女性MTHFR和MTRR的遺傳多態性分析[J].中國婦幼健康研究,2016,27(2):252-255.

[5]向長港,魯衍強,馬少杰,等.眉山市656例漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性分析[J].山東醫藥,2015,55(14):22-25.

[6]楊文方,樊靜,李丹陽,等.亞甲基四氫葉酸還原酶多態性與早期妊娠丟失風險的關系研究[J].中國婦幼健康研究,2015,26(6): 1128-1130.

[7]Yadav U, Kumar P, Yadav S K,etal.“Polymorphisms in folate metabolism genes as maternal risk factor for neural tube defects: an updated meta-analysis”[J].Metab Brain Dis,2015,30(1):7-24.

[8]Zhao J Y,Qiao B,Duan W Y,etal.Genetic variants reducing MTR gene expression increase the risk of congenital heart disease in Han Chinese populations.[J].Eur Heart J,2014,35(11):733-742.

[9]崔會玲,魯衍強,馬少杰,等.鄭州市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態性分布[J].中南大學學報(醫學版),2015,40(7):710-714.

[10]Hou N,Chen S,Chen F,etal.Association between premature ovarian failure,polymorphisms in MTHFR and MTRR genes and serum homocysteine concentration[J].Reprod Biomed Online,2016,32(4):407-413.

[11]吳文慶,周玉珍,魯衍強,等.蘇州市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性[J].江蘇醫藥, 2015, 41(1):71-73.

[專業責任編輯：楊文方]

Correlation analysis of SNP polymorphisms of MTHFR and MTRR with recurrent miscarriage of Han Chinese pregnant women

WANG Kai-lin

(Department of Gynecology and Obstetrics, Kunshan NO.4 People’s Hospital，Jiangsu Kunshan 215331, China)

Objective To explore the correlation of Single nucleotide polymorphisms (SNP) polymorphism of MTHFR and MTRR with recurrent miscarriage of Han Chinese pregnant women. Methods Between January 2012 and February 2015 190 non pregnant women with no clear cause of recurrent abortion visiting Kunshan NO.4 People’s Hospital were selected in observation group, and 180 healthy non pregnant women taking medical examination at the same period were selected in control group. SNP in C677T and A1298C loci of MTHFR gene and A66G locus of MTRR gene were compared between two groups. Results In the observation group frequency distribution of C677T allele in MTHFR gene was significantly higher than in the control group (32.11% vs 21.94%), and the difference was statistically significant (χ2=9.647,P=0.002). Frequency distribution of A1298C allele in MTHFR gene was 34.47% in the observation group and 30.83% in the control group, and the difference was not significant (χ2=1.113,P=0.291). In the observation group frequency distribution of A66G allele in MTRR gene was significantly higher than in the control group with statistical significance (32.37% vs 15.28%,χ2=29.558,P=0.000).Conclusion The polymorphism of C677T locus of MTHFR gene and A66G locus of MTRR gene is closely related to recurrent abortion.

methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)；methyltransferase reductase (MTRR)；single nucleotide polymorphisms (SNP)；Han Chinese pregnant women; recurrent abortion; correlation

2016-06-23

王開林(1972-)，女，副主任醫師，主要從事婦產科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.010

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1195-03