熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染方法的建立

王良玉，郭東星,2，蔚 然，辛德莉,2

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050；2.北京熱帶醫學研究所，北京 100050)

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熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染方法的建立

王良玉1，郭東星1,2，蔚 然1，辛德莉1,2

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京 100050；2.北京熱帶醫學研究所，北京 100050)

目的 建立Taqman探針法熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的實驗室診斷方法。方法 針對肺炎鏈球菌自溶素基因設計引物及探針，建立熒光定量PCR Taqman探針法檢測肺炎鏈球菌感染。采用肺炎鏈球菌標準株，構建質粒，用質粒構建標準品，擴增標準品，繪制標準曲線并檢驗新建熒光定量PCR的敏感性，采用本實驗凍存其他菌DNA樣本，檢測其特異性；采集2015年9月至2015年12月份北京地區家5家醫院兒童門診或病房，診斷為呼吸道感染患兒的咽拭子標本133例，對新建熒光定量PCR法進行臨床樣本的驗證。結果 繪制了熒光定量PCR Taqman探針法檢測肺炎鏈菌感染的標準曲線；新建熒光定量PCR可檢測的肺炎鏈球菌最低拷貝數為10copies/μL；新建熒光定量PCR可成功區分幾種病原體DNA，具有較好特異性；采用新建熒光定量PCR檢測臨床樣本132例，其中肺炎鏈球菌陽性25例，陽性率為18.94%。結論 新建立的熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的實驗室診斷方法具有較高的敏感性和特異性，可用于臨床樣本的檢驗。

肺炎鏈球菌；兒童呼吸道感染；實驗室診斷方法；熒光定量PCR

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia，SP)屬于芽孢桿菌綱，鏈球菌屬，可定植于呼吸道粘膜，與人類共生，無致病性。當呼吸系統防御功能及肺部正常清除功能受損時，可引起呼吸系統疾病[1]。肺炎鏈球菌是人類感染性疾病的重要病原體，據估計，全球范圍內每年約有1 400萬人感染肺炎鏈球菌，約100萬人死于肺炎鏈球菌感染，其中兒童所占比例較高[2]。Rudan等[3]報道，肺炎仍是導致兒童死亡的首要病因，其中，由肺炎鏈球菌感染引起的死亡約占33%。肺炎鏈球菌所致疾病以肺炎為主，可繼發腦膜炎，菌血癥，中耳炎等其他疾病，對兒童健康構成較大威脅[4]。對肺炎鏈球菌感染的診斷，治療及預防策略仍是比較重要的挑戰。而及時準確的病原學診斷，對臨床治療藥物的選擇和治療方案的制定起到十分重要的作用。

針對肺炎鏈球菌的診斷，細菌培養和普通聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的方法已用于可疑臨床病例標本中肺炎鏈球菌的檢測和病例的輔助診斷。傳統的分離培養存在實驗條件和人員要求較高，培養所需時間較長，易與草綠色鏈球菌混淆等問題，隨著抗生素的廣泛使用又給肺炎鏈球菌的培養增加了細菌培養難度[5]。目前我國肺炎病例的診斷多為臨床診斷，缺乏病原學檢測結果。分子生物學診斷技術，因其快速、敏感、特異等優點，越來越多的學者選擇采用分子生物學方法診斷病原體感染[6-7]。本研究建立了一種Taqman 探針法熒光定量PCR，以期為肺炎鏈球菌感染的實驗室診斷、流行病學調查提供一種快速、簡便、易于推廣的手段。

1材料與方法

1.1研究對象

采集2015年9月至2015年12月期間就診于北京市兒童醫院、北京朝陽醫院等5家醫院的兒童呼吸道感染患兒，咽拭子標本133例，凍存于-80℃冰箱備用。入組標準：①具有發熱，伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染癥狀之一的患者，病程在1～7天的門診和住院病人；②血常規：白細胞總數5.0～12.0×109/L，中性粒細胞<70%；③年齡6個月～14歲，性別不限。排除標準：①重癥肺炎或出現多系統、多器官損害者；②患嚴重肝臟、腎臟、心血管及造血系統疾病、免疫系統疾病及精神疾病的患兒。

1.2研究方法

1.2.1引物及探針

針對肺炎鏈球菌自溶素基因序列，設計特異性引物SP-F/SP-R，及探針SP-P，引物及探針序列見表1。引物及探針均由美國Invitrogen公司合成，經高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)方式純化。

表1 引物及探針序列

Table 1 Primers and probe sequences

引物及探針名稱序列SP-PTGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGSP-FACGCAATCTAGCAGATGAAGCASP-RTCGTGCGTTTTAATTCCAGCT

1.2.2構建標準品

復蘇并培養2015年4月購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection ATCC)ATCC的肺炎鏈球菌標準株，采用康為世紀高純度質粒小提試劑盒 (PurePlasmid Mini Kit 貨號：CW0500S，生產批號：20121)提取質粒，并對提取的質粒進行定量分析，之后10倍稀釋，構建濃度梯度為107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL的質粒作為標準品，保存于-80℃備用。

1.2.3繪制標準曲線

以標準品為模板進行熒光定量PCR，繪制標準曲線。熒光定量PCR反應體系：2×Taqman緩沖液12.5μL，SP-F/SP-R 引物各0.5μL，Probe 0.5μL ，DNA 模板5.0μL，ddH2O 9μL，總體積28.0μL。反應條件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。采用ABI 公司熒光定量PCR 儀7500 的SDS 軟件分析實驗結果并繪制標準曲線。

1.2.4方法學驗證

1.2.4.1靈敏性 采用凍存于-80℃的標準品，檢測新建的熒光定量PCR的靈敏性。采用和繪制標準曲線時相同的反應體系和反應條件。

1.2.4.2特異性 采用本實驗保存大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標準株提取的質粒，檢測新建實驗方法的特異性。

1.2.4. 3臨床樣本檢測 采用通用型柱式基因組提取試劑盒(生產廠家：北京康為世紀生物科技有限公司)提取采集的133例臨床咽拭子樣本的DNA。采用新建的熒光定量PCR法檢測臨床樣本。反應體系和反應條件參照繪制標準曲線時選擇的體系和條件。根據樣本擴增的CT值判定陰性和陽性，Ct值<39結果判定為陽性。

2結果

2.1標準曲線

用SP-F/SP-R引物擴增標準品，以標準品濃度為橫坐標，相應的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線如圖1。標準曲線方程：Y=-3.3449X+40.9037，R2=0.999；模板量與Ct值具有良好的相關性，能夠對模板定量。

注：模板拷貝量[log(copies/μL)]

圖1 新建熒光定量PCR標準品擴增曲線

Fig. 1 Amplification curves of newly developed fluorescence quantitative PCR standard samples

圖2 新建熒光定量PCR標準品擴增曲線

Fig. 2 Amplification curve of newly established fluorescence quantitative PCR standard smaples

2.2靈敏性

10倍梯度稀釋肺炎鏈球菌標準株提取的質粒，檢驗新建熒光定量PCR的靈敏度。新建熒光PCR檢測基因模板的最低拷貝數為10copies/μL。

2.3特異性

分別采用本實驗保存大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標準株提取的質粒，檢測新建實驗方法的特異性。結果顯示新建熒光定量PCR的能成功區分以上幾種病原體DNA，具有良好特異性。

2.4臨床樣本檢測

用新建熒光定量PCR檢測臨床樣本提取的DNA，結果顯示，132例咽拭子標本，其中Ct值<39者有25例，判定為陽性，陽性檢出率為18.94%。

3討論

3.1建立兒童肺炎鏈球菌感染實驗室診斷方法的必要性

肺炎鏈球菌主要寄居在人的鼻咽部，是社區獲得性肺炎的常見致病菌之一，兒童、老年人等免疫力相對較差的人群是主要感染的人群。在中國兒童社區獲得性肺炎中13%～53%是肺炎鏈球菌引起，也是<5歲兒童肺炎鏈球菌感染引起死亡病例最多的國家之一[8]。目前病原學檢查，可以診斷60%以上的社區獲得性肺炎的感染病原[9]。但現有的診斷方法仍存在一定問題，滿足不了臨床需求。常采用的診斷肺炎鏈球菌感染的方法為分離培養法，但由于其影響因素較多，不利于臨床及時快速診斷，給治療帶來一定困難[10]。因此需要進一步探討研究更為快速，靈敏、經濟、操作簡單，易于推廣的診斷方法。

3.2本研究方法診斷肺炎鏈球菌感染的優勢

由于分子生物診斷方法具有快速、簡便、靈敏性特異性均較高的優勢，近年來，越來越受到國內外學者的青睞。本研究建立了敏感、快速的Taqman探針法熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌感染的方法，以輔助臨床診斷。新建的實驗室診斷方法能檢測的最低拷貝數為10copies/μL，采用本實驗室保存的大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標準株提取的質粒，驗證了實驗方法的特異性，結果顯示能區分上述病原體，說明本方法不存在交叉反應，具有良好特異性。另外，Taqman探針法因其具有序列特異性，只與互補區結合，熒光信號與擴增的拷貝數具有一一對應的關系，靈敏度高，條件優化容易[11]；操作簡單用時較短，有助于臨床快速做出診斷，及時選擇合適抗生素，盡快制定出準確合理的治療方案。張亞維[12]的研究報道中認為熒光定量PCR優于傳統培養。曹東林等[13]同樣建立了Taqman探針法熒光定量PCR肺炎鏈球菌感染的方法，并將其與傳統的分離培養進行比較，發現熒光定量PCR敏感性優于分離培養。而本次建立的熒光定量PCR檢測的最低拷貝數為10 copies/μL，敏感性更高于曹東林等建立的診斷方法。完成實驗方法的優化和驗證后，將本方法應用于臨床樣本的檢驗，檢測臨床樣本132例，測得肺炎鏈球菌感染25例，陽性率為18.94%。與曹東林等的檢出率基本一致。

綜上所述，認為本方法具有較高的敏感性、特異性。可以作為臨床診斷肺炎鏈球菌感染、進行流行病學調查等的一種輔助手段。

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[專業責任編輯：侯 偉]

Developing a fluorescent quantitative PCR method for detection of streptococcus pneumonia infection

WANG Liang-yu1, GUO Dong-xing1,2, WEI Ran1, XIN De-li1,2

(1.Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China;2. Beijing Tropical Medicine Research Institute, Beijing 100050, China)

Objective To develop a Taqman probe fluorescence quantitative PCR assay for detection of streptococcus pneumonia (SP). Methods Primer and probe were designed according to SP autolysin and fluorescence quantitative PCR Taqman probe were established to detect SP infection. The standard plasmids extracted from SP standard strains were used to constitute and amplify standard samples. The sensitivity of the fluorescence quantitative PCR assay was tested by established standard curves. The specificity of fluorescence quantitative PCR assay was tested by the DNA samples of other bacteria frozen in the laboratory. Meanwhile, 133 throat swab samples from inpatients and outpatients children diagnosed as respiratory infection were collected from 5 hospitals in Beijing area from September 2015 to December 2015 to validate the fluorescence quantitative PCR assay. Results The standard curve of fluorescence quantitative PCR Taqman assay detecting SP was made. This newly-developed method could detect at least 10 copies of SP, and could successfully distinguish several DNAs of the pathogens with good specificity. Newly developed fluorescence quantitative PCR was used to detect 132 clinical samples, including 25 positive SP with positive rate of 18.94%. Conclusion The fluorescence quantitative PCR assay is of great sensitivity and specificity, and it can be widely used for the detection of SP.

streptococcus pneumonia (SP); respiratory tract infections in children; laboratory diagnostic method; fluorescence quantitative PCR

2016-08-22

國家自然科學基金資助項目(編號：81271890)

王良玉(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事兒科學的研究。

辛德莉，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.006

R725.6

A

1673-5293(2016)10-1184-03