星蟲多糖提取工藝優化及其抗氧化作用研究

劉凱麗，賈瑞博，李燕，李鑫，劉斌，黃一帆*

（1.福建農林大學食品科學學院，福州350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福州350002；3.福建農林大學動物科學學院，福州350002）

星蟲多糖提取工藝優化及其抗氧化作用研究

劉凱麗1，2，賈瑞博1，2，李燕1，2，李鑫2，劉斌1，2，黃一帆3*

（1.福建農林大學食品科學學院，福州350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福州350002；3.福建農林大學動物科學學院，福州350002）

以星蟲多糖提取率為評價指標，考察不同料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率4個因素對超聲輔助提取星蟲多糖的影響。在單因素試驗的基礎上，通過響應面優化試驗確定了星蟲多糖超聲輔助提取的最佳工藝條件為料液比1∶25(g∶mL)，超聲溫度70℃，超聲時間50 min，超聲功率400 W。在此工藝條件下進行驗證試驗，星蟲多糖提取率的平均值為7.01%。體外抗氧化研究結果表明，星蟲多糖對DPPH自由基、羥自由基清除率分別為76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

星蟲多糖；超聲波；響應面試驗；工藝優化；抗氧化

海洋星蟲又稱沙蟲，在我國古代醫學著作中多有記載，中醫認為其有清肺補虛、滋陰降火的功效，有著“海洋里的冬蟲夏草”和“動物人參”的美譽。研究表明，星蟲中的主要活性成分為蛋白質、多糖、礦物質元素等，對調節機體多種機能具有重要的作用。隨著海洋生物資源的進一步開發和對糖類藥物研究的日益重視，海洋動物多糖的研究與開發也將越來越受到關注，成為熱點之一。海洋動物多糖具有許多重要的生理活性，如抗腫瘤、抗病毒、降血脂、抗氧化及改善免疫功能[1]。目前國內外對星蟲的研究主要集中在養殖技術[2]、營養分析[3]、藥用價值[4-5]等方面，對星蟲活性物質的生理活性研究表明，星蟲多糖具有抗輻射、抗疲勞、抗氧化、抗病毒、調節免疫[6-10]等多種生物學功能。

多糖的提取方法主要有酶法、溶劑浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等。目前星蟲多糖的提取多為熱水浸提法、堿提法、酶解法，但存在耗時較長、對溫度等條件要求較高且提取率較低等問題[11-12]。而用超聲波提取星蟲多糖是一種物理過程，不僅能保證試材的生物活性在短時間內保持不變還可提高提取率，縮短提取時間。利用響應面優化法可以對多種試驗因素及其相互作用的有效性進行分析，因此，本研究采用超聲波輔助提取法對星蟲多糖進行提取，考察料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率4個因素對星蟲多糖提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，運用響應面法，確定提取星蟲多糖的最佳條件，同時對星蟲多糖體外抗氧化活性進行研究，期望為海洋多糖的研究和海洋藥物的開發提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮮方格星蟲：市售。

葡萄糖，無水乙醇，三氯乙酸，苯酚，濃硫酸，硫化亞鐵，過氧化氫，鄰羥基苯甲酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

HH-3A數顯三用水浴鍋：金壇市精達儀器制造廠；SC-3612低低速離心機：科大創新股份有限公司；EO2140電子分析天平：賽多利斯科學儀器北京有限公司；SHB.IIIS循環水多用真空泵：上海申生科技有限公司；DHG-9240A電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技有限公司；R201旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；TYPEFDU-1000冷凍干燥機：東京理化器械株式會社；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3試驗方法

1.3.1多糖的提取

取勻漿后的方格星蟲50 g，經超聲輔助提取后，用八層紗布過濾，抽濾后上清液經旋轉蒸發儀濃縮至體積的1/3后，加入4倍體積的無水乙醇，4℃過夜。4 500 r/min離心10 min取沉淀，沉淀即為粗多糖，用3%三氯乙酸脫蛋白3次后調pH值為7.0，將多糖溶液流水透析24 h后得到星蟲多糖提取液。

1.3.2葡萄糖標準曲線[13]

精確稱取烘干至恒質量的葡萄糖0.100 0 g，加入適量蒸餾水溶解，轉移至1 000 mL容量瓶中定容備用，得到質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。吸取標準葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于20 mL試管中，加入蒸餾水至1.0 mL，搖勻。然后向其中加入5%苯酚溶液1.0 mL，再快速垂直加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置10 min，將試管放在40℃水浴鍋中反應15 min，拿出后冷卻至室溫，用紫外可見分光光度計于波長490 nm處測其吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程。

1.3.3單因素試驗

料液比：分別取方格星蟲50 g，超聲功率300 W，超聲時間為60 min，超聲溫度為80℃，研究不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））對星蟲多糖提取率的影響。

超聲功率：分別取方格星蟲50 g，料液比1∶20（g∶mL），超聲時間為60 min，超聲溫度為80℃，研究不同超聲功率（200 W、250W、300W、350W、400W）對星蟲多糖提取率的影響。

超聲時間：分別取方格星蟲50 g，超聲功率300 W，超聲溫度為80℃，料液比1∶20（g∶mL），研究不同超聲時間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min）對星蟲多糖提取得率的影響。

超聲溫度：分別取方格星蟲50 g，料液比1∶20（g∶mL），超聲時間為60 min，研究不同超聲溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）對星蟲多糖提取率的影響。

1.3.4響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間為試驗因素，以多糖提取率（Y）為響應值，設計4因素3水平響應面分析試驗，對多糖提取工藝進行優化分析，因素及水平見表1。

表1　星蟲多糖提取工藝優化響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

1.3.5分析方法

多糖的測定：吸取適量提取液，按1.3.2的方法測定樣品在波長490 nm處的吸光度值，通過回歸方程計算提取液中多糖的含量。星蟲多糖提取率計算公式如下：

式中：C為星蟲多糖溶液的質量濃度，mg/mL；V為星蟲多糖溶液的體積，mL；m為星蟲干質量，g。

1.3.6體外抗氧化研究

羥自由基（·OH）清除能力：按照參考文獻[14]的方法進行測定，·OH清除率計算公式如下：

DPPH·清除能力：按照參考文獻[15]的方法進行測定，DPPH·清除率計算公式如下：

2　結果與分析

2.1標準曲線的測定

以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標準曲線線性回歸方程為y=0.981x+0.0033，相關系數R2=0.997 6，標準曲線的擬合度良好，表明吸光度值在葡萄糖質量濃度0～1.2 mg/mL的范圍內有良好的線性關系。

2.2單因素試驗結果

綜上所述，高速公路的大規模施工在我國不斷展開，不但使人們的實際需求得到了滿足，也使社會各界越來越關注路施工的質量，廣大人民群眾也漸漸重視軟土路基施工的質量，鑒于此，相關施工技術人員應該深入了解路基的真實情況，不斷優化、創新軟土路基的施工技術，提升軟土路基的施工質量。

2.2.1料液比對星蟲多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，星蟲多糖提取率逐漸增加，在料液比為1∶20（g∶mL）時星蟲多糖提取率達到最高，繼續增大料液比，多糖提取率急劇下降。可能的原因是料液比較低時，溶液的黏度過高，使得多糖難以析出，隨著料液比的增大，多糖的擴散性增強，多糖提取率有所提高，但料液比過高，溶劑過多，增加了超聲波下細胞破壁的阻力，致使星蟲多糖提取率下降。因此，選取1∶20（g∶mL）為星蟲多糖提取最佳料液比。

圖2　料液比對星蟲多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ratio onSipunculus nuduspolysaccharides yield solid-liquid

2.2.2超聲功率對星蟲多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，星蟲多糖的提取率逐漸增加，在超聲功率為400 W時星蟲多糖提取率達到最高，繼續升高超聲功率，星蟲多糖提取率趨于穩定?？赡艿脑蚴请S著超聲功率的增大，細胞破壁程度增強，較多的多糖可以進入溶劑，致使多糖提取率增加。因此，選取400 W為星蟲多糖提取最佳超聲功率。

圖3　超聲功率對星蟲多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.2.3超聲時間對星蟲多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著超聲時間的增加，星蟲多糖提取率逐漸增加，在60 min時星蟲多糖提取率達到最高，繼續延長超聲時間，星蟲多糖提取率呈現下降趨勢?？赡艿脑蚴浅晻r間過短，多糖的提取不夠充分，隨著超聲時間的增加，破壁的效果增強致使多糖的溶出率增加，但超聲時間過長，多糖的次級鍵被破壞致使多糖降解，從而多糖的提取率降低。因此，選取60 min為星蟲多糖提取最佳超聲時間。

圖4　超聲時間對星蟲多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time onSipunculus nudus polysaccharides yield

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，星蟲多糖提取率迅速增加，在60℃時星蟲多糖提取率達到最高，繼續升高超聲溫度，星蟲多糖提取率基本趨于穩定。可能的原因是隨著溫度的提高，多糖的溶解度增強，擴散性提高，致使多糖提取率增加，當溫度到達一定水平，多糖的溶解度基本不再發生變化，使得多糖提取率基本穩定，但溫度過高，部分多糖可能會水解為單糖、低聚糖等，降低了星蟲多糖提取率。因此，選取60℃為星蟲多糖提取最佳超聲溫度。

圖5　超聲溫度對星蟲多糖提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature onSipunculus nudus polysaccharides yield

2.3星蟲多糖提取工藝的響應面優化

2.3.1響應面試驗設計及結果

在單因素的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選取料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）為4個試驗因素，以星蟲多糖提取率（Y）作為響應值，設計4因素3水平試驗，試驗設計及結果見表2。

表2　星蟲多糖提取工藝優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for Sipunculus nuduspolysaccharide extraction condition optimization

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2結果進行多元模型擬合回歸分析，得到星蟲多糖提取率（Y）對料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）的二次多項回歸模型方程：

對回歸模型進行方差分析和系數顯著性檢驗，結果見表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for quadric regression model of experiment

由表3可知，星蟲多糖得率響應面模型的F值為46.5363，P＜0.000 1差異極顯著；失擬項的F值為5.271 4，P=0.061 7，差異不顯著，說明該模型擬合性較好，數據無異常點，因此由不確定因素所帶來的影響可以忽略。模型的決定系數R2= 0.979 0，說明提取率的變化有97.90%來源于所選的4個變量，即料液比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率；該模型調整決定系數R2Adj=0.957 9；預測樣本決定系數R2=0.885 1。由于預測樣本的決定系數與調整后的決定系數較一致，故可以得出該模型擬合度良好，回歸方程能較好的描述各因素與響應值之間的關系，此模型可用于對星蟲多糖提取得率的分析和預測，試驗方法有效可靠。

由表3可知，該模型中一次項中B、C、D對該模型的影響達到極顯著（P＜0.01）水平，A對該模型的影響達到顯著（P＜0.05）水平。二次項中A2和C2和D2對該模型的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）；此外，該模型的交互項中AD、BC和BD均達到了極顯著水平（P＜0.01）。因此可以得出，試驗因子對響應值的影響并不是簡單的線性關系，且影響星蟲多糖提取率因素的順序為：超聲溫度（B）＞超聲功率（D）＞超聲時間（C）＞料液比（A）。

2.3.2交互項作用對星蟲多糖提取率影響的分析

通過Design-expert 8.0.6軟件，由多項二次回歸方程可得到響應面圖，見圖6。

圖6　料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率交互作用對星蟲多糖提取率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid-liquid ratio,ultrasound temperature, time and power onSipunculus nuduspolysaccharide extraction rate

由圖6可知，該模型的交互項中AD、BC和BD均達到了極顯著水平（P＜0.01）。對二次多項式回歸方程進行計算，得到最佳的提取條件為料液比為1∶24.87（g∶mL），超聲溫度為69.33℃，超聲時間為47.88 min，超聲功率為386.68 W，預測提取得率為7.029 5%。考慮試驗的可操作性，將參數修正為料液比1∶25（g∶mL），超聲溫度70℃，超聲時間50min，超聲功率為400 W。進行5次驗證試驗，得星蟲多糖平均提取率為7.01%，與理論預測值基本一致。

2.4星蟲多糖體外抗氧化活性測定

圖7　星蟲多糖及VC對DPPH(a)以及·OH(b)的清除活性Fig.7 Scavenging activity ofSipunculus nuduspolysaccharide and vitamin C on DPPH(a)and·OH(b)

由圖7可知，隨著樣品質量濃度的增加，星蟲多糖對DPPH自由基、羥自由基清除率隨之增加。在星蟲多糖質量濃度為10 mg/mL時，對DPPH自由基、羥自由基清除活性分別達到76.31%、56.93%。均略低于維生素C對DPPH自由基、羥自由基的清除作用。

3　結論

通過單因素和響應面優化試驗確定了超聲波輔助提取星蟲多糖最佳工藝條件：料液比1∶25（g∶mL），超聲溫度70℃，超聲時間50min，超聲功率400W，在此工藝條件下星蟲多糖平均提取率為7.01%。體外抗氧化研究結果表明，星蟲多糖對DPPH自由基、羥自由基清除率分別為76.31%、56.93%，有一定的抗氧化作用。

[1]范巧云，李朝品，王克霞.海洋動物多糖生物學作用研究新進展[J].中國病原生物學雜志，2012（11）：876-877.

[2]張虹，曾達，艷華.可口革囊星蟲繁殖生物學研究概況[J].大眾科技，2015，17（4）：114-115.

[3]梁川，劉小玲.廣西兩種星蟲營養及生物質量比較分析[J].輕工科技，2016（1）：8-11.

[4]沈先榮，蔣定文，賈福星，等.方格星蟲延緩衰老作用研[J].中國海洋藥物，2004（1）：30-32.

[5]蔣定文，沈先榮，賈福星，等.海洋星蟲提取物的營養分析及免疫調節作用的初步觀察[J].中國生化藥物雜志，2004，25（2）：96-97.

[6]沈先榮，蔣定文，陸敏，等.方格星蟲提取物的抗輻射作用[J].中國海洋藥物，2008，27（2）：33-35.

[7]劉玉明，錢甜甜，莫琳芳，等.方格星蟲多糖對運動小鼠抗疲勞實驗研究[J].中國海洋藥物，2012，31（3）：44-46.

[8]夏乾峰，譚河林，覃西，等.方格星蟲多糖抗乙型肝炎病毒的實驗研究[J].山東醫藥學，2010，50（7）：44-45.

[9]BAI J P.Immunomodulatory activities on macrophage of a polysaccharide fromSipunculus nudusL.[J].Food Chem Toxicol,2011,49(11)：2961-2967.

[10]DUBOIS M,A GILLES K,HAMILTON J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem,1956, 28(3)：350-356.

[11]許明珠，張琴，童潼.方格星蟲多糖水法提取的條件及優化[J].廣西科學，2013，20（4）：285-288.

[12]張琴，童潼，許明珠.酶法提取方格星蟲多糖的條件及優化[J].廣西科學，2014，21（2）：158-163.

[13]張帥，鄭寶東，林良美.筍殼多糖的微波-超聲波聯合輔助提取工藝優化及其抗氧化活性[J].食品科學，2015，36（16）：72-76.

[14]賈瑞博，趙慧，劉凱麗.樹舌靈芝總三萜提取工藝優化及其抗氧化作用研究[J].應用化工，2016，45（6）：1030-1035.

[15]XIONG S L,LI A,HUANG N,et al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber ofOphiopogon japonicas[J].Carbohyd Polym,2011,86(86)：1273-1280.

Extraction process optimization and antioxidant activity ofSipunculus nuduspolysaccharide

LIU Kaili1,2,JIA Ruibo1,2,LI Yan1,2,LI Xin2,LIU Bin1,2,HUANG Yifan3*
(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China; 3.College of Animal Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

UsingSipunculus nuduspolysaccharide extraction yield as evaluation index,the effect of solid-liquid ratio,ultrasonic power,temperature and time onS.nuduspolysaccharide extraction yield was studied.Based on single factor experiment results,the optimal extraction technology was determined by Box-Behnken experiment as follows：solid-liquid ratio 1∶25(g∶ml),temperature 70℃,time 50 min,and power 400 W.Under these conditions,verification tests results showed that the average extraction yield ofS.nuduspolysaccharide was 7.01%.In vitroantioxidant activity results showed that the scavenging effect ofS.nuduspolysaccharide on DPPH and·OH was 76.31%and 56.93%,respectively.which showed certain antioxidant activity.

Sipunculus nuduspolysaccharide;ultrasonic;response surface methodology;extraction process optimization;antioxidant

TQ914.1

0254-5071（2016）08-0115-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.026

2016-04-21

國家科技支撐計劃子課題（2014BAD15B01）；福建省科技重大專項（2014NZ2002-1）；菌草食藥用菌產業化關鍵技術研究與示范”福建省科技重大專項（2014NZ 2002-1）

劉凱麗（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

黃一帆（1954-），男，教授，博士，研究方向為天然藥物研究與應用。