一株產果膠酶荷葉內生真菌的分離鑒定

趙曉璐，周寧，唐咸來，謝慶武*

（1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530004；2.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004；3.廣西壯族自治區科學技術廳，廣西南寧530022）

一株產果膠酶荷葉內生真菌的分離鑒定

趙曉璐1，2，周寧1，唐咸來3，謝慶武1*

（1.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530004；2.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004；3.廣西壯族自治區科學技術廳，廣西南寧530022）

以果膠為唯一碳源，通過剛果紅染色法從荷葉中篩出1株產果膠酶的內生真菌HY2。根據形態學特征與ITS序列分析，將菌株HY2鑒定為炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)。該菌在28℃、150 r/min條件下發酵培養10 d，經3,5-二硝基水楊酸法(DNS)法測定發酵液中果膠酶酶活為62.9 U/mL。

荷葉；內生真菌；炭疽菌屬；果膠酶

植物內生真菌是生活史的一個階段或全部階段生活于健康植物組織內部，不引起宿主明顯病癥的真菌，包括一些表生的腐生菌、潛伏性病原菌和菌根菌[1]。近年來，關于植物內生真菌代謝產物的研究日益增多。研究表明，植物內生真菌能夠產生黃酮類化合物[2-3]、青蒿素[4]、紫杉醇[5-6]、生物堿[7-8]等具有多種藥用功效的天然活性物質。但目前關于植物內生真菌代謝產物的研究大多局限于次級代謝產物的藥用活性，鮮有關于植物內生真菌初級代謝產物果膠酶的報道。果膠酶是能夠分解果膠質的多種復合酶類的總稱，現已在食品、制藥、生物技術等領域廣泛應用，是一類重要的工業酶制劑[9]。果膠酶主要靠微生物發酵法進行工業生產，已發現有多種細菌和真菌可產果膠酶（如芽孢桿菌屬[10-11]、青霉屬[12-14]、曲霉屬[15-16]、酵母屬[17]等）。本研究采用剛果紅染色法從荷葉中篩選到一株高產果膠酶的荷葉內生真菌HY2，依靠菌落形態特征、光學顯微形態特征及ITS序列分析進行鑒定，并利用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosali cylic acid colorimetry，DNS）法對其發酵液的果膠酶酶活進行測定，以期為果膠酶的工業生產提供新方法和材料，豐富產果膠酶的微生物種類，也為植物內生真菌初級代謝產物的綜合利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮荷葉：廣西大學校園；D-半乳糖醛酸（≥95%）：日本東京化成工業株式會社；蘋果果膠（70%～75%酯化）：北京博奧拓達科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（≥96%）：天津博迪化工股份有限公司；酒石酸鉀鈉（≥99%）：成都市科龍化工試劑廠；苯酚（≥99%）：上海九邦化工有限公司；無水亞硫酸鈉（≥97%）：天津達森化工產品銷售有限公司；乙酸鈉（≥99%）：中國醫藥（集團）上海化學試劑公司；剛果紅（指示劑）：天津市科密歐化學試劑有限公司；GelRed：美國Biotium公司。

基礎培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[18]。

發酵培養基：果膠1%、K2HPO40.2%、FeSO40.01%、NaNO30.3%、MgSO40.05%，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；EPOCH酶標儀：美國基因有限公司；ZQZC-C型振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；Fresco 21型冷凍高速離心機：美國賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器：寧波新芝生物科技股份有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

DNS溶液：稱取3.15 g 3,5-二硝基水楊酸溶于100 mL超純水中，40℃水浴完全溶解后，依次加入10 g氫氧化鈉、91 g酒石酸鉀鈉、2.5 g苯酚和2.5 g無水亞硫酸鈉，不斷攪拌至完全溶解。冷卻后，用超純水定容至500 mL，貯存于棕色瓶，放置1周后使用。

質量分數1%剛果紅溶液：準確稱量1.0 g剛果紅，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。

質量分數0.1%D-半乳糖醛酸溶液：準確稱量0.1gD-半乳糖醛酸，用pH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至100 mL。

質量分數1%果膠溶液：準確稱量1.0 g果膠，用pH=5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解并定容至100 mL。

1.3.2內生真菌的分離與純化

取新鮮的荷葉葉片用清水洗凈，置于凈化工作臺內，用無菌剪刀將葉片切成1cm×1cm的小塊，首先用體積分數為75%的乙醇溶液浸泡1 min，無菌水漂洗3次，然后用質量分數為2.5%的次氯酸鈉溶液浸泡4min，無菌水漂洗3次。以最后一次漂洗后的無菌水均勻涂布于基礎培養基平板上，無任何菌落生長表明消毒徹底。將消毒后的葉片置于基礎培養基平板上，每板放置4～5塊，置于28℃培養箱內培養。每天觀察，待切口處長出足量菌絲體后，依據真菌的形態特征，用接種環挑取菌絲體劃線至基礎培養基平板上，待長出單個菌落后，挑取單菌落多次劃線后獲得純種菌體，再點接至基礎培養基試管斜面上，28℃條件下培養，至菌落飽滿后，依次編號，置于4℃冷凍保藏。

1.3.3產果膠酶內生真菌的篩選及粗酶液的制備

用接種環小心挑取少量純化后菌株的菌絲體，接種至裝有100mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，28℃、150r/min培養10 d后，將發酵液于4℃、4 000 r/min離心10 min，除去菌絲體后得上清液。通過剛果紅染色法確定產果膠酶的內生真菌，具體操作為：取2支試管，分別加入5 mL發酵液上清液與無菌的液體發酵培養基，再加入500 μL質量分數1%剛果紅溶液染色，隔天觀察。果膠為多糖分子，剛果紅能夠與多糖分子結合形成紅色復合物，當發酵培養基中的果膠被分解后，果膠含量降低，從而使染色較淺。因此能在發酵培養基內生長且剛果紅染色較對照組淺，表明該菌株能夠產生果膠酶分解果膠。所得上清液即為粗酶液，4℃保存備用。

1.3.4形態學鑒定

菌落形態觀察：點接菌絲體于基礎培養基平板上，28℃培養5 d，每天觀察菌落形態。

顯微形態觀察：采用載玻片培養觀察法觀察菌絲體的顯微形態特征[19]。

1.3.5總DNA的提取及ITS序列的PCR擴增

采用濾紙抽濾法獲得28℃、150 r/min條件下培養5 d的菌絲體，將抽濾得到的菌絲體置于60℃干燥箱內烘干至恒質量后剪碎，置于5 mL離心管中并加入少量液氮，用研磨器研磨至粉末。采用天根試劑盒提取菌體基因組DNA。

采用真菌通用引物（ITS1和ITS4）擴增ITS序列。其中引物1：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），引物2：ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系：總體積50 μL；ddH2O 30 μL；5×Fast Pfu Buffer，10 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide trphosphates，dNTPs）4 μL；引物1（20 μmol/L）1 μL；引物2（20 μmol/L）1 μL；模板（總DNA）3 μL；Fast Pfu DNA聚合酶1 μL。PCR反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸45s，共30個循環；72℃總延伸5min。利用天根DNA純化回收試劑盒（離心柱型）對PCR產物進行純化，由華大基因測序。

1.3.6系統發育樹構建

通過在線網站美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的BLAST工具，對測得的ITS拼接序列進行相似性搜索。經MEGA6.0軟件選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹，bootstrap自檢值≥50%，1 000次重復。

1.3.7果膠酶酶活測定

采用DNS法測定果膠酶活。取1.5 mL果膠溶液，50℃預熱5 min。向其加入0.5 mL粗酶液，反應30 min后立即加入2.5mLDNS溶液，沸水煮3 min，立即用冰水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20 mL。在波長540 nm處測定吸光度值，重復3次。根據D-半乳糖醛酸標準曲線（y=1.249x-0.135 97，相關系數R2=0.999 09）計算還原糖含量。

酶活定義：在pH=5.0、反應溫度50℃條件下，1 mL粗酶液分解果膠每小時產生1 mgD-半乳糖醛酸為一個酶活單位（U/mL）。

2　結果與分析

2.1產果膠酶內生真菌的篩選

依據真菌的形態特征，從新鮮健康的荷葉中分離得到5株內生真菌，分別命名為HY1、HY2、HY3、HY4和HY5。對5株內生真菌進行發酵培養后，發現菌株HY2在發酵培養基內長勢良好并產生較多菌絲體，且剛果紅染色后發現菌株HY2發酵液上清染色程度明顯較對照組淺，表明菌株HY2能夠產生果膠酶，具有降解果膠的能力。因此，以菌株HY2作為目的菌株進行深入研究。

2.2菌株形態學鑒定

將菌株HY2接種至基礎培養基平板上，28℃培養5 d，觀察其菌落形態和顯微形態特征，結果見圖1。由圖1可知，菌株HY2在基礎培養基平板上生長迅速，5 d后菌落直徑可達6.3 cm，初生剛毛為白色，菌落圓形，邊緣整齊；從菌落中央開始，剛毛混生，為綠褐色或黑色，呈毛絨狀，孢子盤呈圓形，剛毛散生于孢子盤上。光學顯微鏡下菌株HY2菌絲體分枝不分隔，密集成柵欄狀；分生孢子梗從菌絲體間生出，短，無色，有隔膜；分生孢子無色，成新月形或橢圓形，直或微彎；附著孢成黑色或黑褐色。參照《真菌鑒定手冊》[20]，初步將菌株HY2鑒定為真菌界半知菌類黑盤孢目炭疽菌屬。

圖1　菌株HY2的菌落形態與顯微形態特征(10×40)Fig.1 Colony morphology and micro-morphology characteristics of strain HY2(10×40)

2.3分子生物學鑒定

圖2　菌株HY2 ITS序列的PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of ITS sequence of strain HY2

選擇產果膠酶內生真菌HY2進行ITS序列鑒定。采用天根試劑盒提取菌體HY2基因組DNA，進行PCR擴增，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。由圖2可知，在500 bp附近出現了單一明亮的條帶。PCR擴增產物的測序結果顯示，菌株HY2的ITS序列長為574 bp。

將獲得的ITS序列進行相似性檢索并構建系統發育樹，結果如圖3所示。

圖3　菌株HY2的ITS序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HY2 based on ITS sequence

由圖3可知，菌株HY2與炭疽菌（Colletotrichumsp. 109AC/S GenBank登錄號：GU066674.1）的序列具有很高的相似性，達到99%。結合菌落形態學特征和分子生物學鑒定的結果，將荷葉內生真菌HY2鑒定為炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）。

2.4菌株HY2酶活測定結果

將菌株HY2在28℃、150 r/min條件下發酵培養10 d，獲得粗酶液。采用DNS法測定粗酶液酶活，測得粗酶液中的果膠酶酶活為62.9 U/mL。白蘭芳等[21]從柑橘園土樣中分離獲得的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JLSP-13產果膠酶酶活最大為37.6 U/mL，王齊瑋等[22]從大麻籽中篩選到7株產果膠酶的內生細菌最高酶活為21.8U/mL，表明內生真菌HY2發酵后的粗酶液具有較高的酶活，有一定應用價值。

3　結論

本研究從新鮮健康荷葉中分離得到5株內生真菌，初步發現菌株HY2在發酵培養基中生長良好，能夠產生果膠酶分解利用果膠。經形態學特征和分子生物學鑒定，該菌為炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）。該菌在28℃、150 r/min條件下發酵培養10 d，測得粗酶液中果膠酶酶活為62.9 U/mL，具有較高的工業應用潛力，可以通過該菌進行果膠酶的生產。

[1]王磊，章衛民，潘清靈，等.白木香內生真菌的分離及分子鑒定[J].菌物研究，2009，7（1）：37-42.

[2]周寧，趙曉璐，謝慶武.甘蔗葉內生真菌Aspergillus nigerGZ-4總黃酮含量測定方法研究[J].化學與生物工程，2016，33（1）：63-66.

[3]劉紫英.產黃酮成分的綏草內生真菌的鑒定[J].菌物學報，2011，30（1）：133-137.

[4]周小林，厲大偉，周依婷，等.青蒿素內生真菌IS928產青蒿素類化合物的發酵培養基優化[J].安徽農業科學，2015，43（32）：38-43.

[5]汪友明，馬忠友，胡豐林，等.黃山地區紅豆杉中產紫杉醇內生真菌的分離和篩選[J].天然產物研究與開發，2014，26（10）：1624-1627.

[6]席曉圓，宋發軍，張鵬，等.產紫杉醇內生真菌MHZ-32的鑒定[J].中國生物化學與分子生物學報，2015，31（4）：429-434.

[7]高嘉卉，南志標.禾草內生真菌生物堿的研究進展[J].生態學報，2007，27（6）：2531-2546.

[8]馬養民，馮成亮.植物內生真菌生物堿活性成分的研究進展[J].有機化學，2009，29（8）：1182-1191.

[9]李祖明，張洪勛，白志輝，等.微生物果膠酶研究進展[J].生物技術通報，2010（3）：42-49.

[10]LI Z M,JIN B,ZHANG H X,et al.Purification and characterization of three alkaline endopolygalacturonases from a newly isolatedBacillus gibsonii[J].Chin J Process Eng,2008,8(4)：768-773.

[11]AHLAWAT S,DHIMAN S S,BATTAN B,et al.Pectinase production byBacillus subtilisand its potential application in biopreparation of cotton and micropolyfabric[J].Process Biochem,2009,44(5)：521-526.

[12]HADJ-TAIEB N,AYADI M,TRIGUIi S,et al.Hyperproduction of pectinase activities by a fully constitutive mutant(CT1)ofPenicillium occitanis[J].Enzyme Microb Tech,2002,30(5)：662-666.

[13]SILVA D,TOKUIOSHI K,DA SILVA M E,et al.Production of pectinase by solid-state fermentation withPenicillium viridicatumRFC3[J]. Process Biochem,2005,40(8)：2885-2889.

[14]李瑜，樊明濤，袁輝，等.聚半乳糖醛酸酶高產菌的篩選及產酶條件研究[J].中國釀造，2009，28（2）：56-59.

[15]BAI Z H,ZHANG H X,QI H Y,et al.Pectinase production byAspergillus nigerusing wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance[J].Bioresource Technol,2004,95(1)：49-52.

[16]EL-SHEEKH M M,ISMAIL A S,EL-ABD M A,et al.Effective technological pectinases byAspergillus carneusNRC1 utilizing the Egyptian orange juice industry scraps[J].Int Biodeter Biodegr,2009,63(1)：12-18.

[17]FERNANDEZ-GONZALEZ M,UBEDA J F,VASUDEVAN T G,et al. Evaluation of polygalacturonase activity inSaccharomyces cerevisiae wine strains[J].FEMS Microbiol Lett,2004,237(2)：261-266.

[18]周德慶.微生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2013：350.

[19]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999：45.

[20]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979：463-475.

[21]白蘭芳，高慧，劉明啟，等.產果膠酶枯草芽孢桿菌的鑒定、發酵條件優化及產物酶學性質的研究[J].中國畜牧雜志，2011，47（19）：63-68.

[22]王齊瑋，吳寧，杜官本，等.大麻籽內生菌果膠酶的菌株篩選初探[J].纖維素科學與技術，2015，23（1）：55-59.

Isolation and identification of pectinase-producing endophytic fungus from lotus leaves

ZHAO Xiaolu1,2,ZHOU Ning1,TANG Xianlai3,XIE Qingwu1*
(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Agricultural Bioresources in the Subtropics,Nanning 530004,China;3.The Science and Technology Department of Guangxi, Nanning 530022,China)

With pectin as the sole carbon source,a pectinase-producing endophytic fungus HY2 was screened from lotus leaves by Congo red staining method.According to morphological characteristics and ITS sequence analysis,the strain HY2 was identified asColletotrichumsp.Under the conditions of temperature 28℃,rotate speed 150 r/min and fermentation time 10 d,the pectinase activity in the fermentation liquid was 62.9 U/ml by 3,5-dinitrosalicylic acid method.

lotus leaves;endophytic fungus;Colletotrichumsp.;pectinase

Q939.9

0254-5071（2016）08-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.021

2016-03-09

廣西壯族自治區研究生教育創新計劃項目（P3130098105）

趙曉璐（1990-），女，碩士研究生，研究方向為資源與環境微生物。

謝慶武（1959-），男，副研究員，碩士，研究方向為生物技術。