應用DNA復合條形碼技術研究秦嶺水生動物多樣性

李 杰, 楊 婧，黃 原

陜西師范大學生命科學學院, 西安 710062

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應用DNA復合條形碼技術研究秦嶺水生動物多樣性

李 杰, 楊 婧，黃 原*

陜西師范大學生命科學學院, 西安 710062

基于新一代測序技術的DNA復合條形碼技術,以其簡便快捷和省時省力的特點,已經成為監測生物多樣性的主要方法。采用這一技術,選取COⅠ和18S rRNA兩個條形碼標記,對秦嶺5個淡水水域內,不同生境下10個樣品的水生動物多樣性進行了初步調查。區系組成結果顯示：18S rRNA基因鑒定了9門42綱52目,COⅠ基因鑒定了5門11綱36目,而兩個條形碼標記共鑒定了10門48綱89目。群落組成分析結果顯示：COⅠ分析得到樣本中含量相對較高的類群是雙翅目、毛翅目、基眼目、鞘翅目、蜉蝣目等；而18S rRNA分析得到樣本中主要有節肢動物門、軟體動物門和扁形動物門三個大門。此外,兩者的分析結果也表明所選樣地下游的類群數要高于上游。α多樣性分析結果顯示：金龍峽、灃峪口和石砭峪3個受人類影響較大樣地的群落豐富度和群落多樣性相對較高,而五臺山和子午峪兩個自然樣地的物種豐富度和群落多樣性相對較低,表明一定程度的外來干擾會對一個地方的水生生物多樣性有明顯的提高。β多樣性分析結果顯示,不同環境因素下樣品的群落結構差異性較大,而相似環境因素下樣品的群落結構差異性則相對較小。此外,在聚類分析時,環境相似性較高的樣品首先聚集在一起,而且群落相似性也相對較高。

DNA復合條形碼；秦嶺；水生動物；生物多樣性

DNA復合條形碼技術(DNA metabarcoding)是在DNA條形碼基礎上結合高通量測序技術和分子分類學技術興起的一種用于生物多樣性檢測的方法。該技術既可以在短時間內對大量樣本的物種組成進行識別,也可以對大批量的多物種混合環境樣本進行快速的DNA條形碼鑒定,避免了單物種DNA條形碼鑒定的低效率[1- 3]。隨著高通量測序技術的進步、條形碼參考數據庫的完善和分析軟件的開發,DNA復合條形碼技術已經成為生物多樣性檢測最常用的方法。

復合條形碼技術從誕生以來廣泛應用于多方面的研究,如Yang等采用18S rDNA作為標記基因分析了土壤小型動物的多樣性[4]；Hajibabaei等對格蘭德河水生生物多樣性進行了研究[5]；Nolte等比較了奧地利一個湖中不同季節原生動物多樣性[6]；Porazinska等比較了哥斯達黎加不同熱帶雨林微生境中線蟲類的生物多樣性[7]。此外,DNA復合條形碼在微生物和真菌多樣性[8- 9]、動物排泄物以及食性結構[10]和古細菌[11]的研究上都有很廣泛的應用。

自然界內江河、湖泊、水庫眾多,水生生物種類繁多,其中水生動物是最主要的類群,包括浮游動物和底棲動物。浮游動物包括原生動物、輪蟲、枝角類和橈足類等,底棲動物包括扁形動物門、環節動物門、節肢動物門等[12]。由于廣泛的水域面積和復雜的水生環境,關于水生動物多樣性的研究,雖然有很多發現,但仍然有一些科學問題亟待解決。秦嶺是橫亙于我國中部東西走向的巨大山脈,是我國的南北分界線[13]。其內部山谷眾多,大小溪流貫穿其中,水生生態環境復雜,但目前還缺乏對水生動物區系和群落的研究。因此,本文選取COⅠ和18S rRNA基因作為條形碼標記,用DNA復合條形碼技術對秦嶺水生動物區系組成和群落結構組成進行了初步研究,同時用α和β多樣性以及聚類分析來比較不同生境和取樣環境下,水生動物多樣性組成的差別,為秦嶺生物多樣性的保護和研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與準備

從秦嶺中選擇金龍峽、石砭峪、五臺山、子午峪和灃峪口5個淡水水域,分上下游取樣,在上下游分別設置3個采樣點,每個采樣點用50mL凍存管取30mL水樣,同時用毛筆和鑷子在采樣點的石頭上或底層采集肉眼可見底棲動物,放入50mL凍存管中。采樣地點和環境如表1所示。

將采得的水樣帶回實驗室用真空抽濾機濃縮,一個樣地3個取樣點的水樣濃縮為一個浮游動物水樣。然后將濃縮水樣和底棲動物用100%乙醇保存,放入-20℃的冰箱,用于提取總DNA。

1.2 總DNA的提取

將濃縮水樣和底棲動物,混合放入一個經高壓滅菌的1.5mL離心管中,用DNeasy Tissue and blood kit(Qiagen Inc)試劑盒提取總DNA,得到10個DNA樣品,編號如表1所示。

表1 樣品采集的地點及環境

1.3 PCR擴增以及測序

根據Hajibabaei等[5]和Nolte等[6]類似研究采用的引物,實驗擴增COⅠ序列的正向引物為LepF1：5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG- 3′,反向引物為EPT-long-univR： 5′-AARAAAATYATAAYAAANGCGTGN ANNGT- 3′,擴增長度約為130bp；擴增18S rRNA序列的正向引物為fw：5′-ATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGG- 3′,反向引物為rv：5′-CTGGAATTACCGCGGSTGCTG- 3′,擴增長度約為180- 200bp。為了能夠同時對多個樣品進行測序,以及在后續分析中區分每個樣品序列,在每個樣品的5′端都加了一個7bp的標簽序列。

實驗中PCR體系為25μL,包括12.5μL 的2×Taq PCR StarMix with Loading Dye,1.0μL的DNA模版,上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各1μL,9.5μL的雙蒸水。COⅠ基因的擴增循環程序是：95℃ 5min預熱,35個循環：95℃ 40s,43.5℃ 1min,72℃ 30s,72℃ 5min延伸,4℃保溫；18S rRNA基因的擴增循環程序是：98℃ 2min預熱,35個循環：98℃ 30s,65℃ 45s,72℃ 90s,72℃ 7min延伸,4℃保溫。

PCR產物送往上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序,采用Illumina MiSeq平臺,進行雙末端測序。最后將得到的測序數據返回,進行數據處理和生物多樣性分析。

2 數據處理和分析

2.1 原始序列處理：質量過濾和嵌合體的去除

首先,將返回的雙末端Fataq序列用fastqc軟件對序列文件進行質量檢測；然后用trimmomatic 0.33軟件進行質量過濾,要求步長為1的5bp窗口從第1個堿基開始移動,窗口中堿基的平均質量≥Q20(即堿基準確率為99%),從第1個低于Q20處截斷序列,最終要求序列長度≥150bp,且不容許有模糊堿基；然后利用Flash軟件對質量過濾的序列進行拼接,要求兩個序列數據的最大重疊片段≥10bp,且不容許有堿基錯配。

由于PCR擴增可能會產生嵌合體,測序過程中會產生點突變等測序錯誤,因此還要對拼接后的序列進一步的過濾和去除嵌合體。實驗用Qiime[14]軟件進行序列過濾,用mothur[15]軟件去除嵌合體序列。

2.2 OTU分類和注釋

實驗用Qiime軟件中的uclust[16]對所得到的優質序列按照0.97的相似度進行OTU聚類,選取每個OTU中最長序列為代表序列；用Qiime軟件中的blast,將得到的代表序列與數據庫比對,獲得OTU分類學信息。其中18S rRNA基因與Silva[17]數據庫比對,COⅠ基因與BOLD數據庫比對。

然后,根據注釋得到的精簡OTU列表,用excel和mothur軟件做目水平上的群落組成圖和樣品間venn圖。

2.3 群落多樣性分析

根據物種豐度,用mothur軟件中的summary.single命令,求出每個樣品的Chao,ACE,Shannon和Simpson指數。其中Chao和ACE指數是群落豐富度(Community richness)指數,二者的值越大,說明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數是群落多樣性(Community diversity)指數,Simpson指數越大,說明群落多樣性越低,Shannon指數越大,說明群落多樣性越高。

用Qiime軟件,根據各樣品的物種進化和豐度信息,進行Unifrac分析[18- 19],得到樣品間差異距離矩陣,然后進行PCoA分析。

2.4 聚類分析

根據精簡后的OTU列表,用R軟件中的pheatmap程序包進行屬水平上的聚類分析,并繪制出heatmap[20- 21]圖。

3 結果

3.1 測序結果

原始序列經過濾和嵌合體的去除,兩個標記基因共得到1120240條有效序列,971319條優質序列,其中18S rRNA的有效序列有767441條,優質序列有640700條,而COⅠ的有效序列有352799條,優質序列有330619條,它們的優質序列所占比例分別為：83.49%和93.71%。

3.2 區系組成和群落結構

將優質序列與數據庫比對,共得到水生動物10門48綱89目,其中18S rRNA鑒定了9門42綱52目,COⅠ鑒定了5門11綱36目。其中18S rRNA鑒定的各樣品組成情況是：J1包含31目55科,J2包含23目41科,D1包含28目49科,D2包含24目44科,W1包含27目45科,W2包含25目41科,Z1包含23目47科,Z2包含20目46科,F1包含20目35科,F2包含19目30科。

圖1 COⅠ基因在種水平上的venn圖(圖中1和2分別代表所有取樣點的下游和上游)Fig.1 The venn diagram for COⅠ gene in the species level (1 and 2 represents the downstream and upstream of all the sample plots, respectively)

根據OTU列表做venn圖,如圖1和圖2所示,COⅠ鑒定得到：J1與J2的共有物種數是218,特有物種數分別為212和152；D1與D2的共有物種數是236,特有物種數分別為95和116；W1與W2的共有物種數是88,特有物種數分別為214和170；Z1與Z2的共有物種數是122,特有物種數分別為153和208；F1與F2的共有物種數是265,特有物種數分別為80和123；所有取樣點下游與上游的共有物種數是628,特有物種數分別是272和155；D、F、J、W和Z的總物種數分別是：683、733、800、560和605；18S rRNA鑒定得到：J1與J2的共有物種數是154,特有物種數分別為65和47；D1與D2的共有物種數是158,特有物種數分別為74和28；W1與W2的共有物種數是131,特有物種數分別為56和67；Z1與Z2的共有物種數是160,特有物種數分別為49和68；F1與F2的共有物種數是139,特有物種數分別為43和53；所有取樣點下游與上游的共有物種數是305,特有物種數分別是11和10；J、D、W、Z和F的共有物種數是140,特有物種數分別為3、2、9、2和0,D、F、J、W和Z的總物種數分別是：418、374、420、375和437。

圖2 18S rRNA基因在種水平上的venn圖Fig.2 The venn diagram for 18S rRNA gene in the species level圖中1和2分別代表所有取樣點的下游和上游,J、D、W、Z和F分別代表每個取樣地上游和下游的總和

根據OTU列表,可以用樣品在各分類水平(門、綱、目、科、屬)上的物種組成比例情況,來反應樣品在不同分類水平上的群落結構。COⅠ從目水平上分析結果如圖3所示：D1、D2、F1、F2、J1、J2和W1中雙翅目的含量相對較高,所占比例分別為45.2%、46.3%、46.9%、27.1%、83.1%、53.9%和48.9%；W2中毛翅目的含量較高,所占比例為56.6%；Z1中基眼目的含量較高,所占比例為29.3%；Z2中鞘翅目的含量相對較高,所占比例為45.3%。18S rRNA從門水平上分析結果如圖4所示：D1、D2、J1、J2、W1、Z1和Z2中節肢動物門的含量相對較高,所占比例分別為59.2%、84.5%、92.7%、65.8%、91.6%、53.5%和66.9%；F1和F2中軟體動物門的含量相對較高,所占比例分別為55.2和58.6%；W2中扁形動物門的含量相對較高,所占比例為54.5%。可見,COⅠ調查表明：樣本中含量相對較高的類群是雙翅目、毛翅目、基眼目、鞘翅目、蜉蝣目等；而18S rRNA調查表明：樣本中主要有節肢動物門、軟體動物門和扁形動物門三個大門。

圖3 COⅠ基因目水平上群落組成圖Fig.3 The community composition diagram for COⅠ gene on the order level

圖4 18S rRNA基因門水平上群落組成圖Fig.4 The community composition diagram for 18S rRNA gene on the phyla level

3.3 α多樣性分析

COⅠ基因的Chao和ACE指數表明J1、J2和F2的群落豐富度相對較高,Z1、W2和Z2的則相對較低；Simpson和Shannon指數表明J1、Z2和F2的群落多樣性相對較高,而J2、D1和W2的則相對較低。18S rRNA基因的Chao和ACE指數表明J1、D1和J2的群落豐富度相對較高,而F1、F2和W1的則相對較低,Simpson和Shannon指數表明J1、Z1和W2的群落多樣性相對較高,而F2、F1、和D2的則相對較低。整體來看,J、F、D的群落豐富度和群落多樣性相對較高, Z、W的則相對較低。

3.4 β多樣性分析

用樣品間物種進化和豐度信息,進行Unifrac分析,得到樣品間差異距離矩陣,然后用差異距離矩陣進行PCoA分析,得到PCoA圖,如圖5所示,圖中兩點之間的距離越近說明兩者之間的生物群落差異性越小。18S rRNA基因的PCoA圖顯示：Z1、D2和J1,J2和D1之間的生物群落結構差異性較小；COⅠ基因的PCoA圖顯示：D1、Z1、D2和J2,Z2和W2之間的生物群落差異性較小。

圖5 各樣品在對群落結構影響最大兩因素下的PCoA圖Fig.5 The PCoA diagram for each sample in the two most important factors that affect the community structure

3.5 聚類分析

18S rRNA基因的聚類情況顯示Z2、J2和D2,F2和F1,W1和W2,Z1和D1在屬水平上群落相似性相對較高(圖6)；COⅠ基因的聚類情況顯示J2、D2、D1和Z2,J1和W1,F1和F2,Z1和W2在屬水平上的群落相似性相對較高(圖7)。

圖6 18S rRNA基因在屬水平上的Heatmap圖Fig.6 The heatmap diagram for 18S rRNA gene on the genus level

圖7 各樣品COⅠ基因在屬水平上的Heatmap圖 Fig.7 The heatmap diagram for COⅠ gene on the genus level

4 分析與討論

4.1 環境因素與結果討論

由于水環境的復雜性和多變性,使得水生生物多樣性受多方面影響,其可以分為自然因素和人為因素兩個方面[12]。自然因素主要包含上下游、水體深淺以及流動性等,而人為因素主要是指人類活動對生物多樣性的影響。本文主要從以上這些方面對秦嶺水域的水生動物多樣性做了初步調查。

對于水流來說,水的流動性會讓上游的營養物質向下游流動,使得下游的營養高于上游,從而導致下游的物種豐富度高于上游[22]。從venn圖可以看到,各樣地下游的物種豐度普遍高于上游；群落結構圖顯示,各樣地下游的群落結構比上游的復雜,并且下游群落結構中優勢物種的含量也高于上游；從α多樣性指數可以看到,雖然個別樣品上游的群落豐富度和群落多樣性較下游的高,但絕大多數樣品下游的群落豐富度和群落多樣性還是較上游的高。可見,本次調查也表明下游的物種豐富度要高于上游。

實驗選擇了秦嶺中5個淡水水域：灃峪口、五臺山、子午峪、金龍峽和石砭峪,其中灃峪口,金龍峽和石砭峪在景區內,人為干擾較大,而子午峪和五臺山相對來說人為干擾較小,基本上處于自然狀態。從實驗結果可以看出各樣地之間的不同：如各樣地物種豐度的大小順序是：W

對一個生態系統來說,影響生物多樣性的因素是多方面的,除了前面所述的上下游和人為活動的影響外,本實驗還關注了水的深淺、流動性以及陽光的有無對生物多樣性的影響。如取自深水的D2和F1樣品與取自淺水的D1和F2樣品,跟其他都取自淺水的樣品相比,有相對較多的共有物種； PCoA圖分析表明不同環境因素下樣品的群落結構差異性較大,而相似環境因素下樣品的群落結構差異性則相對較小,如J2和D2都是取自較陰暗的上游流動水,取樣環境相似,因此它們之間的群落結構差異性相對較小。此外,Heatmap圖也顯示,環境相似性較高的樣品首先聚集在一起,并且群落相似性相對較高,如Z1和D1都是取自較淺的下游靜水,取樣環境相似,因此它們首先聚類在一起,表明它們之間的群落相似性相對較高。

4.2 實驗方法與結果討論

實驗結果顯示,兩個分子標記所得的實驗結果并不完全一致。這主要是由于每個基因的通用引物在不同類群中的擴增能力和在數據庫中的覆蓋范圍不同導致的。對基于高通量測序的復合條形碼技術來說,由于樣品的復雜性和多重性,在研究時如果選擇多個分子標記基因可能會得到更全面的實驗結果,如本論文中18S rRNA基因鑒定了9門42綱52目,COⅠ基因鑒定了5門11綱36目,而兩個分子標記基因共同鑒定了10門48綱89目。Carew[25]等人的研究結果也表明,使用兩個或兩個以上的分子標記可以更全面的鑒定到樣本中所包含的物種。這使得一些依賴于類群數計算的各種生物多樣性指數,將變得更加準確。但是在使用多個分子標記進行分析時,由于每個分子標記在進化速率和單獨鑒定的類群上不同,可能使得構建的系統發育樹之間有區別,從而影響了依賴于系統發育樹計算的unifrac分析結果。

目前,應用DNA復合條形碼技術對生物多樣性的研究越來越多,但是關于復合條形碼技術的一些本質問題仍然沒有得到很好的解決。其中一個最主要的問題就是：復合條形碼技術只能做定性分析,而不能很準確的進行定量分析。在研究中,一直用序列數的多少來表示物種個體數量的多少,雖然有些研究認為序列數與物種的個體數之間存在相關性,但也僅僅是它們的變化趨勢相對一致,而并不是很完美的契合。因此,在分析的過程中,只能用序列數大致的估計物種的個體數,而不能完全用序列數來代替物種的個體數。Piol[26]等人的研究也表明復合條形碼技術的定量研究能力有限,只有定性分析的結果才是可靠的。對于本研究來說,有些分析會不可避免的應用到物種個體數的多少,如群落結構圖中各樣本中類群的含量,以及α多樣性中的Shannon指數等,所以對于這些結果,只能定性來看,如果想要得到更加精確的結果,還須進一步的驗證。當然,在本實驗中也避免了一些用物種個體數的分析,如沒有使用Bray-Curis指數進行β多樣性的分析,而是使用了依賴于物種數和進化信息的jaccard和unweighted_unifrac指數進行β多樣性和后續的分析。但是,生態學研究中的群落組成和群落結構以及群落之間的關系,都是依賴于物種的個體數量,所以DNA復合條形碼技術還不能很準確的應用到生態學研究中的每一個方面。

雖然復合條形碼技術還不能更精確的進行生物多樣性研究,但相比于傳統耗時耗力以及單一的物種鑒定和生物多樣性研究,復合條形碼技術有明顯的優勢：它能在短時間對大量復合樣本進行物種鑒定和生物多樣性研究,既省時又省力。隨著測序技術的進步和提高,條形碼數據庫的全面和完善,生物信息學軟件的開發和使用,復合條形碼技術將會成為生物多樣性研究的主要方法,并且準確性也會大幅度提高,更重要的是它將能夠進行更大尺度和更大規模的生物多樣性研究。

[1] Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, Brochmann C, Willerslev E. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 2045- 2050.

[2] Ji Y Q, Ashton L, Pedley S M, Edwards D P, Tang Y, Nakamura A, Kitching R, Dolman P M, Woodcock P, Edwards F A, Larsen T H, Hsu W W, Benedick S, Hamer K C, Wilcove D S, Bruce C, Wang X Y, Levi T, Lott M, Emerson B C, Yu D W. Reliable, verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding. Ecology Letters, 2013, 16(10): 1245- 1257.

[3] Coissac E, Riaz T, Puillandre N. Bioinformatic challenges for DNA metabarcoding of plants and animals. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1834- 1847.

[4] Yang C X, Ji Y Q, Wang X Y, Yang C Y, Yu D W. Testing three pipelines for 18S rDNA-based metabarcoding of soil faunal diversity. Science China Life Sciences, 2013, 56(1): 73- 81.

[5] Hajibabaei M, Shokralla S, Zhou X, Singer G A C, Baird D J. Environmental barcoding: A next-generation sequencing approach for biomonitoring applications using river benthos. PLoS One, 2011, 6(4): e17497.

[6] Nolte V, Pandey R V, Jost S, Medinger R, Ottenw?lder B, Boenigk J, Schl?tterer C. Contrasting seasonal niche separation between rare and abundant taxa conceals the extent of protist diversity. Molecular Ecology, 2010, 19(14): 2908- 2915.

[7] Poretsky R S, Hewson I, Sun S L, Allen A E, Zehr J P, Moran M A. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental Microbiology, 2009, 11(6): 1358- 1375.

[8] Schmidt PA, Bálint M, Greshake B, Bandow C, R?mbke J, Schmitt I. Illumina metabarcoding of a soil fungal community. Soil Biology & Biochemistry, 2013, 65: 128- 132.

[9] Bálint M, Schmidt P A, Sharma R, Thines M, Schmitt I. An Illumina metabarcoding pipeline for fungi. Ecology and Evolution, 2014, 4(13): 2642- 2653.

[10] Soininen E M, Zinger L, Gielly L, Bellemain E, Brathen K A, Br?chmann C, Epp L S, Gussarova G, Hassel K, Henden J A, Killengreen S T, R?m? T, Sten?ien H K, Yoccoz N G, Ims R A. Shedding new light on the diet of Norwegian lemmings: DNA metabarcoding of stomach content. Polar Biology, 2013, 36(7): 1069- 1076.

[11] J?rgensen T, Kjer K H, Haile J, Rasmussen M, Boessenkool S, Andersen K, Coissac E, Taberlet P, Brochmann C, Orlando L, Gilbert M T P, Willerslev E. Islands in the ice: detecting past vegetation on Greenlandic nunataks using historical records and sedimentary ancient DNA Meta-barcoding. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1980- 1988.

[12] 章繼華, 何永進. 我國水生生物多樣性及其研究進展. 南方水產, 2005, 1(3): 69- 72.

[13] 劉曉清, 張霞, 王亞萍, 成西娟. 秦嶺地區生物多樣性及其保護對策. 安徽農業科學, 2012, 40(12): 7365- 7367, 7496.

[14] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombauqh J, Bittinger K, Bushman F D, Costello E K, Fierer N, Pea A G, Goodrich J K, Gordon J I, Huttley G A, Kelley S T, Knights D, Koenig J E, Ley R E, Lozupone C A, McDonald D, Muegge B D, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky J R, Turnbaugh P J, Walters W A, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data, Nature Methods, 2010, 7(5): 335- 336.

[15] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, Hall J R, Hartmann M, Hollister E B, Lesniewski R A, Oakley B B, Parks D H, Robinson C J, Robinson C J, Sahl J W, Stres B, Thallinger G G, Van Horn D J, Weber C E. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537- 7541.

[16] Edqar R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2460- 2461.

[17] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Gl?ckner F O. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research, 2013, 41(D1): D590- 596.

[18] Lozupone C, Knight R. Unifrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8228- 8235.

[19] Lozupone C, Hamady M, Knight R. Unifrac-An online tool for comparing microbial community diversity in a phylogenetic context. BMC Bioinformatics, 2006, 7:371.

[21] Deng W K, Wang Y B, Liu Z X, Cheng H, Xue Y. HemI: A Toolkit for Illustrating Heatmaps. PLoS One, 2014, 9(11): e111988.

[22] 周桔, 雷霆. 土壤微生物多樣性影響因素及研究方法的現狀與展望. 生物多樣性, 2007, 15(3): 306- 311.

[23] 羅天相, 劉莎. 中度放牧干擾對草地生物多樣性影響的思考. 安徽農業科學, 2007, 35(21): 6567- 6568, 6612.

[24] 何飛, 何亞平, 黃登才, 劉興良, 費世民, 慕長龍, 蔣俊明, 陳秀明, 隆廷倫, 張旭東. 放牧的環境效應及其對環境保護的負面影響. 四川林業科技, 2009, 30(3): 43- 54.

[25] Crarew M E, Pettigrove V J, Metzeling L, Hoffmann A A. Environmental monitoring using next generation sequencing: rapid identification of macroinvertebrate bioindicator species. Frontiers in Zoology, 2013, 10(1): 45.

Characterizing the aquatic biodiversity of the Qinling Mountains using DNA metabarcoding approach

LI Jie, YANG Jing, HUANG Yuan*

CollegeofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062,China

DNA metabarcoding, a technique based on next-generation genetic sequencing, enables the rapid characterization of species composition in bulk biodiversity samples or when analyzing environmental DNA, and thus facilitates comprehensive, large-scale biodiversity assessments and monitoring. The Qinling Mountain range, extending in an east-west direction across central China, includes a series of valleys traversed by mountain streams of various sizes. Although these streams potentially contain an array of aquatic organisms, the complexity of the environment and the presence of small, cryptic, rare, or poorly characterized species makes studying the aquatic biodiversity of these streams a challenge. The goal of this study was to use DNA metabarcoding to examine the composition of both the aquatic fauna and of the aquatic communities as a whole in the Qinling Mountain streams, employing alpha diversity, beta diversity and cluster analyses to evaluate differences in biodiversity from samples collected from different locations. For this purpose, 10 samples containing both zooplankton and zoobenthos were collected from downstream and upstream locations of five streams (Jin Longxia, Shi Bianyu, Feng Yukou, Wutai Mountain and Meridian Valley) in the Qinling Mountains. The cytochromecoxidase subunit Ⅰ (COⅠ) and 18S ribosomal RNA (18S rRNA) genes were selected as barcoding sequences. Following DNA extraction and PCR amplification using degenerate primers, the amplicons were sequenced on an Illumina MiSeq platform, and Qiime and Mothur software were used to analyze the raw data and to obtain an operational taxonomic unit (OTU) list. Ecological analysis was subsequently performed using Excel, R, and Qiime software. Analysis of the fauna composition revealed that a total of 89 orders, from 48 classes, and 10 phyla were identifiable in the total group of samples using the two gene markers. Individually, 52 orders, from 42 classes, and 9 phyla were identified using the 18S rRNA sequences, and 36 orders, from 11 classes, and 5 phyla were identified using the COⅠ sequences, demonstrating that the two gene markers together resulted in a higher rate of identification than either marker alone. With regard to community composition, analysis of COⅠ gene sequences revealed that the Arthropod orders Diptera, Trichoptera, Ephemeroptera and Coleoptera were the most common taxa, with lower occurrences of Protozoa and Rotifera. Analysis of community composition using the 18S rRNA gene sequences, on the other hand, indicated three main groups in the samples, namely the Arthropda, Mollusca and Platyhelminthes. Both the fauna composition and community composition analyses showed that the number of groups in the downstream samples was higher than that in the upstream samples. Moreover, alpha diversity analysis revealed that the three sampling plots (Jin Longxia, Shi Bianyu and Feng Yukou) most intensively affected by human activities had relatively high values of community richness and diversity compared with the two more natural sampling plots (Wutai Mountain and Meridian Valley), suggesting that aquatic biodiversity may be improved if a location has a certain degree of external interference. Finally, beta diversity analysis demonstrated that, although community variations may be very obvious when samples collected from different environments are compared, such variations may not be so obvious in samples collected from similar environments, with cluster analysis showing that community similarity values in such samples are relatively high.

DNA metabarcoding; Qinling Mountains; aquatic animal; biodiversity

國家自然科學基金(31372192)

2015- 05- 13;

2016- 03- 21

10.5846/stxb201505130981

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

李杰, 楊婧，黃原.應用DNA復合條形碼技術研究秦嶺水生動物多樣性.生態學報,2016,36(19):6103- 6112.

Li J, Yang J, Huang Y.Characterizing the aquatic biodiversity of the Qinling Mountains using DNA metabarcoding approach.Acta Ecologica Sinica,2016,36(19):6103- 6112.