TGA與LPS競爭抑制妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細胞TLR4經典信號通路

楊 琴，叢 林， 袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 松，李 琴

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TGA與LPS競爭抑制妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細胞TLR4經典信號通路

楊 琴，叢 林， 袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 松，李 琴

目的 研究半乳糖醛酸(TGA)與內毒素(LPS)同時刺激妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細胞及其對LPS-Toll樣受體4(TLR-4)-核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路的抑制作用。 方法 選取妊娠期糖尿病孕婦30例，抽取外周靜脈血15 ml，分離出單核細胞，分別加入LPS、TGA、TGA(0～1.0 mg/ml)聯合LPS刺激并培養，Western blot法檢測TLR4及NF-κB p65蛋白表達量，ELISA法檢測培養液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)水平。 結果 單獨LPS或TGA刺激，其下游TLR4、NF-κB p65蛋白表達量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均較未處理組高，差異有統計學意義(P<0.05)；同時加入TGA及LPS刺激，其TLR4、NF-κB p65蛋白表達量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均較單獨LPS或TGA刺激低，但較未處理組高，差異均有統計學意義(P<0.05)；各組TLR4與NF-κB p65蛋白表達量之間呈正相關性(P<0.01)。結論 TGA與LPS可競爭抑制LPS-TLR4-NF-κB信號通路，對妊娠期糖尿病的預防及治療起到指導作用。

半乳糖醛酸；內毒素；妊娠期糖尿?。籘LR4信號通路

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)所帶來的不良妊娠結局及遠期影響危害較大，近年越來越引起大家的關注，對其機制的研究也越來越多。研究[1]表明GDM與免疫炎癥相關，認為GDM是一種慢性低度炎癥性疾病。前期研究[2]表明GDM孕婦體內Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR-4) mRNA、核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor，NF-κB) mRNA呈高表達，炎癥因子升高，提示存在免疫炎癥，內毒素(lipopolysaccharide，LPS)-TLR4-NF-κB信號通路介導了大量炎癥因子釋放，可能參與了GDM的發病。基于此可針對TLR4信號通路進行調控，觀察其是否對GDM有影響，有研究者運用半乳糖醛酸(trigalacturonic acid，TGA)類物質調控TLR4信號通路并對其分子機制做了探討[3]。該實驗即應用TGA對LPS-TLR4-NF-κB信號通路進行調控，并探討其與GDM的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 GDM孕婦30例，納入標準參照國際妊娠合并糖尿病研究組(IADPSG)標準[4]，年齡21～34(28.20±3.46)歲，孕24～28(25.83±1.14)周。未做任何處理的作為空白對照組，只加LPS(1 μg/ml)刺激作為LPS組，只加TGA(1.0 mg/ml)刺激為TGA組，余除了加LPS(1 μg/ml，參照前期研究[2])刺激外，同時加入TGA刺激，并按加入的TGA濃度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)分為0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組。同時排除胎膜早破、肝腎功能損害、感染、妊娠期高血壓、妊娠期子癇及GDM高危因素等。所有受試者簽署知情同意書，方案已經醫院倫理委員會討論通過。

1.2 標本收集及細胞培養 外周血經肝素化處理后，用人淋巴細胞分離液提取淋巴細胞(按說明書操作)，洗滌提純后用血細胞計數板計數，調整細胞濃度并用臺盼藍測定細胞活力。將細胞置于RPMI 1640培養基中，按上述分組進行處理后，均置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.3 試劑 人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)；LPS、臺盼藍、TGA(美國Sigma公司)；RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；RIPA裂解液、蛋白緩沖液、蛋白A+G瓊脂糖珠(上海碧云天生物技術有限公司)；小鼠抗人TLR4抗體、小鼠抗人泛乙?；嚢彼峥贵w(英國Abcam公司)；小鼠抗人NF-κB p65抗體、β-actin(美國CST公司)；山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；ECL顯影液(美國Thermo公司)；ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。

1.4 ELISA法檢測 培養液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)水平按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 Western blot法檢測TLR4、NF-κB蛋白表達量 RIPA裂解液低溫裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液加入5×蛋白上樣緩沖液，煮蛋白10 min，樣品保存于-20 ℃冰箱。10% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后放入NF-κB p65抗體(1 ∶250)和β-actin(1 ∶1 000)中4 ℃過夜。洗膜，放入二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育2 h，ECL顯影液顯影。

2 結果

2.1 各組之間TNF-α、IL-1、IL-10水平比較 TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對照組、LPS組進行方差分析，TGA組TNF-α、IL-1、IL-10與空白對照組、LPS組比較，差異有統計學意義(F=225.876、289.244、399.918，P<0.01)；與空白對照組、LPS組比較，0.25 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=213.266、251.172、353.225，P<0.01)、0.5 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=188.278、223.004、321.683，P<0.01)、1.0 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=268.099、234.759、410.713，P<0.01)，差異有統計學意義。

2.1.1 各組TNF-α水平比較 空白對照組與LPS組進行比較，TGA組及0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對照組、LPS組進行兩兩比較，結果顯示，空白對照組與LPS組差異有統計學意義(P<0.05)，LPS組、TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對照組比較，差異有統計學意義，LPS組與TGA組比較差異無統計學意義，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統計學意義，見圖1A。

2.1.2 各組IL-1水平比較 各組之間的比較方法同TNF-α，結果顯示，空白對照組與LPS組之間差異有統計學意義(P<0.05)，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組分別與空白對照組比較，差異有統計學意義，而1.0 mg/ml TGA組與空白對照組差異無統計學意義；LPS組、TGA組之間差異無統計學意義，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統計學意義，見圖1B。

2.1.3 各組IL-10水平比較 各組之間的比較方法同TNF-α，結果顯示，空白對照組與LPS組之間差異有統計學意義(P<0.05)，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組分別與空白對照組之間比較，差異有統計學意義，而1.0 mg/ml TGA組與空白對照組差異無統計學意義，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統計學意義，見圖1C。

2.2 外周血單核細胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達 與空白對照組比較，LPS組、TGA組TLR4、NF-κB p65蛋白條帶較深；0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組TLR4、NF-κB p65蛋白條帶較B、C組逐漸變淡，其中1.0 mg/ml TGA組蛋白條帶最淡，見圖2。TLR4、NF-κB p65蛋白表達量LPS組、TGA組較空白對照組多，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組逐漸減少，見表1。

表1 各組TLR4、NF-κB p65 蛋白表達量比較

與空白對照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

2.3 外周血單核細胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達量之間的相關性分析 各組的TLR4與NF-κB p65蛋白表達量之間呈正相關性(r=0.882、0.838、0.939、0.868、0.846、0.853；P<0.01)。

3 討論

GDM是指妊娠期發生的不同程度的糖代謝異常[5]。近期許多研究[6-7]表明炎癥因子與糖尿病之間密切相關，且課題組前期研究[8]表明甘露糖結合凝集素下降可能與炎癥反應相關，初步探討了GDM與免疫炎癥之間的關系。近期研究[2,9-10]顯示LPS-TLR4-NF-κB信號通路參與炎癥因子的釋放，可能參與了GDM的發病。TLR4可表達于免疫細胞胞膜上[11-13]，與胞外LPS結合并介導信號途徑，激活下游系列信號，并最終使轉錄調節因子NF-κB活化，進入胞核啟動轉錄。

圖1 各組TNF-α、IL-1、IL-10水平

A：TNF-α；B：IL-1；C：IL-10；1：空白對照組；2：LPS組；3：TGA組；4：0.25 mg/ml TGA組；5：0.5 mg/ml TGA組；6：1.0 mg/ml TGA組；與空白對照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

圖2 Western blot法檢測各組TLR4、NF-κB p65蛋白表達

1：空白對照組；2：LPS組；3：TGA組；4：0.25 mg/ml TGA組；5：0.5 mg/ml TGA組；6：1.0 mg/ml TGA組

TLR4信號通路參與多種疾病的發生，研究[14-15]顯示在腸道炎性疾病中通過5-TGA調控LPS-TLR4-NF-κB信號通路，下游表達產物減少，對通路起到抑制作用，但其具體機制并不完全清楚。而秦文星[3]則更深入的研究了其抑制作用的分子機制，認為TLR4的配體至少需要乙?；Y構與陰離子基團，LPS具備這個條件；而5-TGA中的羧基，既屬于陰離子基團，又有?；慕Y構特點，也具備與TLR4結合的條件，但LPS與TGA同時作用于TLR4時對TLR4信號通路產生抑制作用。

本研究則運用TGA對TLR4信號通路進行調控，結果顯示TNF-α、IL-1、IL-10水平LPS組較空白對照組高，與前期研究[2,9]結果一致；TGA組細胞因子水平較空白對照組高，與LPS組無明顯差異，提示TGA可能與LPS有相同的作用，即可與TLR4結合并激活下游信號通路；TGA濃度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)的變化，細胞因子水平逐漸降低，在1.0 mg/ml濃度時最低，提示TGA、LPS同時與TLR4作用時可能使下游信號途徑受到抑制，最終導致細胞因子釋放減少。

本研究選取TLR信號通路TLR4、NF-κB p65蛋白這兩個關鍵點對其進行監測，結果表明LPS組、TGA組與空白對照組比較，其TLR4、NF-κB p65蛋白條帶加深，其蛋白表達量升高；LPS組、TGA組蛋白條帶深淺較一致，表達量無明顯差異；LPS+TGA組隨著TGA濃度的變化，其蛋白條帶較LPS組、TGA組逐漸變淡，其中LPS+1.0 mg/ml TGA組蛋白條帶最淡，表達量也逐漸降低。TLR4、NF-κB p65蛋白表達量變化趨勢與細胞因子變化趨勢相同，本研究對TLR4與NF-κB p65蛋白表達量做相關分析，結果顯示各組兩者均呈正相關性，可認為TGA/LPS介導了TLR4-NF-κB 信號通路。由細胞因子及蛋白表達量變化水平可得知，TGA可激活TLR4信號通路，LPS與TGA同時與TLR4作用可抑制此通路，且LPS+1.0 mg/ml TGA作用最明顯，可視為最適抑制濃度。

TGA也有羧基，具備與TLR4結合的條件，且TGA濃度的選擇是根據5-TGA的最適濃度(1.0 mg/ml)[14]上下波動進行預實驗摸索得出，因此其單獨使用與LPS有相同的作用，使得TGA組與LPS組蛋白及細胞因子變化趨勢一致。TGA對通路競爭抑制的可能原因是其使細胞膜上的TLR4受體減少，或TGA-TLR4作用位點與LPS-TLR4作用位點相互干擾，但其具體機制尚需進一步探討。而且，本研究只限于體外細胞刺激，體外環境不受機體內環境的影響，因此TGA是否適用于機體以及其安全性等問題需進一步探究。

綜上所述，TGA可激活TLR4信號通路，也可與LPS競爭抑制GDM孕婦外周血單核細胞LPS-TLR4-NF-κB信號通路，此通路的抑制為GDM的靶向治療提供理論依據，有利于GDM防治工作的開展。

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Trigalacturonic acid competing with lipopolysaccharide inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes

Yang Qin, Cong Lin,Yuan Jing,et al

(Prenatal Diagnosis Center, Dept of Obstetrics and Gynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To study the inhibition of trigalacturonic acid and lipopolysaccharide(LPS) in LPS-TLR4-NF-κB signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. Methods 15 ml of peripheral venous blood was obtained from 30 pregnant women with gestational diabetes and mononuclear cells were isolated. They were cultured with LPS, trigalacturonic acid(TGA), LPS combining with TGA respectively.Western blot and ELISA were used to detect the expressions of TLR4, NF-κB p65 and the level of TNF-α,IL-1,IL-10. Results The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were higher than the control after stimulated with LPS alone or TGA. And the difference was clearly statistically significant(P<0.05). The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were lower compared with LPS alone or TGA when stimulated with LPS combined with TGA. However it was high compared with the control. The differences were both clearly statistically significant(P<0.05).And the correlations between the TLR4 and NF-κB p65 were clearly statistically significant (P<0.01). Conclusion Trigalacturonic acid competing with LPS may inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. And it can provide a guide to the prevention and treatment of gestational diabetes mellitus.

trigalacturonic acid; endotoxin; gestational diabetes mellitus; TLR4 signaling pathway

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.046.html

安徽省自然科學基金(編號：1208085MH172)；安徽高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2011Z215)

安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科產前診斷中心，合肥 230022

楊 琴，女，碩士研究生；

叢 林，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：conglin1957@163.com

R 714.5

A

1000-1492(2016)01-0098-05

2015-09-30接收