GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系

產(chǎn)世鑫，孟翔凌，吳文涌

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GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系

產(chǎn)世鑫，孟翔凌，吳文涌

目的 通過檢測胃癌組織中高爾基體磷酸化蛋白3(GOLPH3)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平，探討二者在胃癌進(jìn)展中的相互關(guān)系。方法 通過免疫組織化學(xué)SP法檢測55例經(jīng)手術(shù)切除的胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中GOLPH3和VEGF蛋白的表達(dá)情況。GOLPH3與VEGF在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果 GOLPH3及VEGF在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為67.27%、58.18%，顯著高于相應(yīng)癌旁組織的18.18%、23.64%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在胃癌組織中的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小等均無顯著相關(guān)性，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有顯著相關(guān)性(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在GOLPH3陽性表達(dá)組的胃癌組織中，VEGF陽性表達(dá)率為75.68%，明顯高于GOLPH3陰性表達(dá)組的22.22%，胃癌組織中GOLPH3表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.508，P<0.01)。結(jié)論 GOLPH3過表達(dá)可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)調(diào)節(jié)胃癌血管生成，從而影響胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

胃癌；高爾基體磷酸化蛋白3； 血管內(nèi)皮生長因子；血管生成

胃癌嚴(yán)重危害著人類健康和生命，其發(fā)病率占全球惡性腫瘤的第4位，因胃癌導(dǎo)致的腫瘤相關(guān)死亡率僅次于肺癌，在世界上排第2位[1]。盡管胃癌的手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療以及相關(guān)靶向治療近些年取得了巨大進(jìn)展，但是胃癌患者的預(yù)后仍然較差，這可能與胃癌的早期癥狀不明顯、患者的就診率低、缺乏有效便利的普查篩選手段，從而導(dǎo)致胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分即為進(jìn)展期有很大的關(guān)系。因此提高胃癌的早期診斷率、明確胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及采取相應(yīng)的治療措施對胃癌患者的診治有著重要意義。高爾基體磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3)是對高爾基體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的，是一種從酵母到人類都高度保守的蛋白質(zhì)[2]。2009年Scott et al[3]通過RNAi 基因敲除和cDNA 過表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)GOLPH3 是一個(gè)具有轉(zhuǎn)化和激活能力的癌基因。Hu et al[4]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中GOLPH3的相對表達(dá)量與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后等相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(vasculoar endothelial growth factor，VEGF)是目前已知的腫瘤血管生成過程中特異性最強(qiáng)的促血管生長因子，其表達(dá)與胃癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[5]。然而針對GOLPH3與VEGF在胃癌組織內(nèi)表達(dá)關(guān)系的研究國內(nèi)外報(bào)道罕見。該研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌組織中GOLPH3與VEGF蛋白表達(dá)情況，探討兩者在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性，從而為胃癌的病理診斷及治療提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料 隨機(jī)選取2012年1月～12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科行胃癌根治性切除手術(shù)患者胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織各55例。所有患者術(shù)前均未行放化療及其他治療，術(shù)前及術(shù)后均行組織病理學(xué)檢查確診及明確臨床病理分期。男43例，女12例；年齡17～80歲(58.84±11.16)歲，其中≥60歲22例，<60歲33例；腫瘤最大直徑≥5 cm者29例，<5 cm者26例；分化程度：高、中分化共22例，低分化共33例；浸潤深度：侵犯漿膜者37例，未侵犯漿膜者18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例；臨床病理分期根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)共同公布的胃癌TNM分期：其中Ⅰ/Ⅱ期患者24例，Ⅲ/Ⅳ期患者31例。患者臨床病理資料均完整。

1.2 主要試劑 兔抗人GOLPH3多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人VEGF單克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色劑等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將石蠟包埋的組織行連續(xù)切片，切片厚度4 μm。所有切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水化，PBS沖洗3次，每次5 min，微波法行抗原修復(fù)；3%過氧化氫溶液浸泡30 min滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫性動(dòng)物血清封閉，置切片于37 ℃濕箱內(nèi)孵育30 min，滴加一抗，即抗GOLPH3抗體或VEGF抗體，置于4 ℃濕箱內(nèi)孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗覆蓋組織，37 ℃濕箱內(nèi)孵育30 min；滴加新配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察最佳顯色時(shí)間，自來水沖洗后行蘇木精細(xì)胞核復(fù)染，0.1%鹽酸酒精浸泡3 min，自來水沖洗，PBS返藍(lán)；脫水干燥，中性樹脂封片，顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4 染色結(jié)果判斷 雙盲情況下，由兩名病理科醫(yī)師分別對每張標(biāo)本切片進(jìn)行染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽性率進(jìn)行雙評分。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色深度：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡(×400)視野，陽性表達(dá)細(xì)胞比例：基本不著色為0分，<10%為1分，10%～35%為2分，36%～70%為3分，>70%為4分。兩者得分相乘，>4分為陽性表達(dá)，≤4分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。GOLPH3及VEGF在胃癌組織及癌旁組織表達(dá)的關(guān)系、GOLPH3及VEGF與胃癌各臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，胃癌組織中GOLPH3表達(dá)與VEGF表達(dá)的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中GOLPH3、VEGF的表達(dá)情況 GOLPH3主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(圖1A1)，在胃癌組織中陽性表達(dá)率67.27%，明顯高于癌旁組織的18.18%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(圖1B1)，在胃癌組織中陽性表達(dá)率58.18%，明顯高于癌旁組織的23.64%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 GOLPH3與VEGF在胃癌及癌旁組織的表達(dá)情況(n)

2.2 GOLPH3、VEGF表達(dá)分別與胃癌各臨床病理特征之間的關(guān)系 胃癌組織中GOLPH3、VEGF的表達(dá)與患者的性別、年齡和腫瘤大小無相關(guān)性，而與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。GOLPH3、VEGF在高、中分化胃癌組織陽性表達(dá)率分別為78.79%、72.73%，明顯高于低分化胃癌組織的50.00%、33.33%(P<0.05)。GOLPH3、VEGF在侵犯漿膜的胃癌組織陽性表達(dá)率分別為81.08%、70.27%，明顯高于未侵犯漿膜的38.89%、33.33%(P<0.05)；GOLPH3、VEGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織陽性表達(dá)率分別為84.62%、74.36%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的25.00%、18.75%(P<0.01)；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者GOLPH3的陽性表達(dá)率分別為37.50%、90.32%(P<0.01)，VEGF在TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期患者的陽性表達(dá)率分別為25.00%、83.87%(P<0.01)。見表2。

2.3 GOLPH3與VEGF在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示，在GOLPH3陽性表達(dá)組的胃癌組織中，VEGF陽性表達(dá)率為75.68%(28/37)，明顯高于GOLPH3陰性表達(dá)組22.22%(4/18)。采用Pearson相關(guān)性分析顯示，GOLPH3蛋白的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性 (r=0.508，P<0.01)。

3 討論

研究[6]顯示，GOLPH3參與執(zhí)行高爾基體的蛋白質(zhì)分選功能，在蛋白質(zhì)的整合、受體循環(huán)以及蛋白質(zhì)的糖基化過程中起重要作用。Scott et al[3]對多種實(shí)體腫瘤的5p13基因拷貝數(shù)增加進(jìn)行系統(tǒng)性分析，并通過基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GOLPH3可能是新的致癌基因，影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)文獻(xiàn)[7-11]報(bào)道，GOLPH3在食管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及卵巢上皮細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象。GOLPH3在惡性腫瘤中的高表達(dá)產(chǎn)物與相關(guān)惡性腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、預(yù)后等密切相關(guān)，也證實(shí)GOLPH3是一種致癌基因，且其表達(dá)產(chǎn)物在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過程中有重要作用，影響癌癥患者預(yù)后。GOLPH3的高表達(dá)通過調(diào)節(jié)高爾基體蛋白質(zhì)糖基化轉(zhuǎn)移酶的活性及功能，使腫瘤相關(guān)蛋白的分泌異常；蛋白質(zhì)的糖基化結(jié)構(gòu)與腫瘤的細(xì)胞生長、黏附、遷移和侵襲都密切相關(guān)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)[12-13]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)/mTOR信號通路的中心調(diào)控位點(diǎn)，已有研究[14]證實(shí)此信號通路對細(xì)胞的增殖、凋亡有著重要的調(diào)控作用，mTOR的異常激活參與了多種腫瘤的形成與進(jìn)展。Scott et al[3]通過比較基因組雜交分析發(fā)現(xiàn)GOLPH3與retromer復(fù)合體的重要組成部分VPS35存在密切相關(guān)性，從而通過這種方式將GOLPH3與mTOR聯(lián)系起來，推測GOLPH3通過mTOR信號通路對惡性腫瘤的生長產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，GOLPH3在胃癌組織中陽性表達(dá)率為67.27%，明顯高于相應(yīng)癌旁組織的18.18%，且GOLPH3的高表達(dá)與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)性。

表2 GOLPH3、VEGF表達(dá)與胃癌患者各臨床病理特征之間的關(guān)系

實(shí)體腫瘤無限制的侵襲性生長及轉(zhuǎn)移都依賴腫瘤組織中新生血管的形成，而上調(diào)的腫瘤血管化作用以及增加的腫瘤促血管生成因子的表達(dá)已經(jīng)證實(shí)與腫瘤的分級或者預(yù)后相關(guān)。VEGF是已知的腫瘤血管生成過程中特異性最強(qiáng)的促血管生長因子，具有明顯的促血管生成作用。VEGF的表達(dá)受多因素的調(diào)控，最重要的因素是低氧。低氧可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)從而上調(diào)VEGF的表達(dá)。VEGF的表達(dá)與癌癥的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，VEGF在胃癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)癌旁組織，并且VEGF高表達(dá)的胃癌患者與其組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，提示VEGF的高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示GOLPH3和VEGF均與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)，提示二者可能對胃癌的進(jìn)展存在某種協(xié)同作用。同時(shí)，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中GOLPH3的高表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈明顯正相關(guān)性，提示胃癌組織中過表達(dá)的GOLPH3可能通過誘導(dǎo)上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌組織中新生血管的形成，進(jìn)一步影響胃癌組織的生長和發(fā)展。其機(jī)制可能是GOLPH3通過激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/mTOR信號通路，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而促使VEGF的表達(dá)增加，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成新生血管增加腫瘤細(xì)胞的血供，促進(jìn)腫瘤的生長[15]。

綜上所述，胃癌組織中GOLPH3、VEGF的陽性表達(dá)與胃癌的進(jìn)展程度均密切相關(guān)，提示二者對胃癌進(jìn)展的診斷有協(xié)同作用，并且胃癌組織中過表達(dá)的GOLPH3可能上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌新生血管的形成，促進(jìn)胃癌的生長及發(fā)展。針對腫瘤血管生成各環(huán)節(jié)的靶向治療是近年來腫瘤研究熱點(diǎn)，抗血管生成藥物也逐漸運(yùn)用于腫瘤的臨床治療。因此，聯(lián)合檢測GOLPH3和VEGF的表達(dá)，可能對胃癌病理診斷、臨床預(yù)后的判斷及豐富胃癌的臨床治療手段有一定的指導(dǎo)意義。

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Relationship between the expression of GOLPH3 with VEGF expression in gastric cancer

Chan Shixin, Meng Xiangling, Wu Wenyong

(Dept of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)

Objective To investigate the interrelationship between Golgi phosphoprotein 3(GOLPH3) expression with vasculoar endothelial growth factor(VEGF) expression in the progression of human gastric cancer by detecting the expression level of GOLPH3 and VEGF. Methods Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the expression of GOLPH3 and VEGF in 55 cases of gastric cancerous and carcinoma-adjacent tissues. Pearson correlation analysis was used to discuss the association between GOLPH3 expression with VEGF expression. Results The immunohistochemical detection showed that the positive expression rates of GOLPH3 and VEGF were 67.27%,58.18% respectively, which were significantly higher than the positive expression rates in carcinoma-adjacent tissues (P<0.05). A statistical analysis revealed that the positive expression rate of GOLPH3 and VEGF in the gastric cancer tissues were strongly correlated with depth of invasion (P<0.05), distant metastasis (P<0.01) and TNM stages (P<0.01), whereas it did not significantly correlate with age or gender or size of tumor. Compared with the negative for the GOLPH3 expression, the VEGF expression in gastric cancer tissues positive for the GOLPH3 expression was significantly higher. The protein level of GOLPH3 expression was positively correlated with VEGF expression (r=0.508,P<0.01). Conclusion GOLPH3 overexpression may regulate gastric angiogenesis by upregulating the expression of VEGF, which affects the invasion and metastasis of gastric cancer.

gastric cancer; GOLPH3; VEGF; angiogenesis

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.040.html

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號：07010300196)；安徽省高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助項(xiàng)目(編號：20133420120006)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，合肥 230022

產(chǎn)世鑫，男，碩士研究生；

孟翔凌，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xianglingm@medmail.com.cn

R 735.2

A

1000-1492(2016)01-0086-04

2015-10-13接收