自體骨髓單個核細胞移植對腦梗死大鼠室管膜下區神經干細胞增殖的影響

蔣 超 孔維霞 朱 麗 羅 煥

鄭州大學第五附屬醫院 1)神經內科 2)超聲醫學科 鄭州 450052

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自體骨髓單個核細胞移植對腦梗死大鼠室管膜下區神經干細胞增殖的影響

蔣 超1)孔維霞2)朱 麗1)羅 煥1)

鄭州大學第五附屬醫院 1)神經內科 2)超聲醫學科 鄭州 450052

目的 研究骨髓單個核細胞對腦梗死后腦源性神經營養因子(BDNF)及室管膜下區神經干細胞增殖的影響，探討骨髓單個核細胞對腦梗死治療作用的可能機制。方法 成年雄性SD大鼠 72只，體質量250～300 g。梯度離心法分離骨髓單個核細胞，流式細胞術檢測細胞純度，將由模型動物股骨骨髓腔內分離出的單個核細胞經尾靜脈途徑移植到大鼠體內；線栓法制作腦梗死動物模型，分別于腦梗死后24 h、72 h通過Western blot技術檢測腦部BDNF的表達；室管膜下區神經干細胞的增殖情況于腦梗死7 d時通過BrdU/Nestin免疫熒光雙染技術進行檢測。結果 經骨髓單個核細胞移植24 h、72 h時，BDNF表達的水平在腦梗死大鼠腦部明顯增高，與模型組及溶劑組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。自體骨髓單個核細胞移植還促進了腦梗死7 d時室管膜下區神經干細胞的增殖，骨髓單個核細胞移植組與模型組以及溶劑治療組比較，差異亦具有統計學意義(P<0.01)。結論 自體骨髓單個核細胞移植可以顯著增加腦梗死大鼠腦部BDNF的表達、并促進室管膜下區神經干細胞的動員。骨髓單個核細胞促進神經干細胞增殖的作用可能與骨髓單個核細胞的神經保護作用有關。

腦梗死；骨髓單個核細胞；腦源性神經營養因子；神經干細胞；神經營養作用

自體神經干細胞的增殖有利于腦梗死后神經功能的恢復，腦內神經的發生受多重因素的調節。缺血性或創傷性損傷可上調成年哺乳動物的內源性神經干細胞的增殖及分化[1，2]。在受損的腦組織，神經干細胞的增殖能力可被腦源性神經營養因子(BDNF)等外界的刺激物所加強[3]。既往研究表明骨髓單個核細胞具有促進神經系統內BDNF分泌的能力，但關于其對神經干細胞增殖影響的研究尚屬少見。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體質量250～300 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。所有操作程序均遵守鄭州大學動物管理委員會規定。動物飼養、管理按二級動物標準進行。按隨機化原則將所用實驗動物分為4組，即假手術組(Control)、模型組(Ischemia)、溶劑治療組(Vehicle)和骨髓單個核細胞治療組(BMMNC)。每組每個時間點6只大鼠用于Western blot檢測，每組6只用于熒光染色。

1．2 腦梗死動物模型制作 大腦中動脈局灶性腦缺血模型的制備采用線栓法[4]。腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。假手術組只分離、暴露血管，不結扎頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍魚線。模型組大鼠，仰臥固定，頸部正中切口，在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，并分離并暴露左側頸總及頸內、外動脈，左側頸總動脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形尼龍魚線，進線長度18～19mm，模型成功后，將頸總動脈連同尼龍魚線一起結扎，縫合皮膚，放回籠內，單籠喂養。選擇右上肢屈曲、行走時向右側旋轉或右側肢體癱瘓的大鼠進行實驗。

1．3 骨髓單個核細胞的分離、純化 腹腔注射水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉大鼠，在脛骨外側皮膚上做一小切口，暴露脛骨，去除骨膜，利用牙科鉆在脛骨上鉆一1.25×2.5 mm的小孔直達骨髓腔，將一細針插入骨髓腔內，并連接到一個肝素化注射器上，通過前后移動細針，抽取骨髓，骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚。將收集到的骨髓細胞進行離心，用含0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌，將洗滌過的細胞懸浮于199培養基內，并將細胞懸液加入含20 mL淋巴細胞分離液的50 mL錐形瓶中、進行離心[5]。收集骨髓單核細胞，用含0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌并進行細胞計數。然后將骨髓單核細胞懸浮于無菌冷磷酸鹽緩沖液內，并達到所需的細胞濃度，備用；假手術組、模型組及溶劑治療組亦經骨髓腔內抽出等量的骨髓細胞，假手術組、模型組不進行細胞移植，溶劑治療組經尾靜脈途徑注射等劑量的生理鹽水。取收集的骨髓單核細胞，制成細胞懸液，計數達1×106，1 000 rpm離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌2次，取1 mL液體，輕搖離心管后，將骨髓單核細胞混勻，加入2 μL一抗(CD45)，室溫孵育1 h，流式細胞儀上機檢測。結果通過儀器CellQuest軟件分析。

1．4 Western blot 檢測腦梗死后BDNF的表達情況分別于腦梗死后24 h、72 h取腦組織，以RIPA裂解液冰浴下裂解并超聲裂解梗死區的皮層組織。采用Bradford法測定蛋白含量，并將分離后的蛋白通過半干途徑轉移至PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉 2 h。加入一抗過夜后，用TBST溶液洗膜 3次，每次洗滌時間為10 min。然后將PVDF膜置于以辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h。用TBST溶液洗膜3次，每次洗滌時間為5 min。X-射線膠片曝光后，對免疫印記條帶的相對密度用電泳圖像分析系統進行分析和定量[4]。

1．5 免疫熒光雙染檢測室管膜下區神經干細胞的增殖 于腦梗死后7 d取腦組織，冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4°C)固定15 min。透膜封閉液封閉透膜2 h含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉 2 h。一抗過夜，二抗室溫孵育切片。分別用PBS洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下，激發/發射波長488/525 nm的FITC呈綠色熒光，激發/發射波長550/565 nm的Cy3呈紅色熒光。

2 結果

2．1 骨髓單個核細胞對腦部BDNF蛋白表達的影響 Western blot定量檢測結果表明，對照組腦組織內BDNF蛋白的表達量較少，經骨髓源性單個核細胞治療后其表達水平明顯增高，而溶劑治療組與模型組腦組織內BDNF蛋白的表達量僅略有增高。統計分析表明，骨髓源性單個核細胞治療組與模型組、溶劑治療組比較，結果均有統計學意義(P<0.01)。說明骨髓源性單個核細胞移植后腦部BDNF的分泌明顯升高。見表1。

表1 腦梗死24 h、72 h時周圍腦組織BDNF的檢測結果 (OD目的條帶/β-actin)

注：*與假手術組及溶劑治療組比較，差異均有統計學意義，P<0.01

2．2 骨髓單個核細胞對室管膜下區神經干細胞增殖的影響 腦梗死7 d時室管膜下區神經干細胞增殖的熒光雙染結果(雙標陽性細胞數)：對照組2.98±1.01，模型組4.16±1.13，溶劑治療組4.33±1.37，黃體酮治療組12.35±2.92。對照組大鼠室管膜下區神經干細胞多處于靜止狀態，Nestin陽性細胞數量很少；缺血7 d時逐漸出現室管膜下區神經干細胞的活化、增殖，Nestin陽性細胞數增加，但是數量不多；經黃體酮治療7 d后，室管膜下區BrdU/Nestin 免疫熒光染色雙陽性的細胞數量明顯增多。經統計學處理表明，4組之間比較，7 d時F(3，23)值為36.63(P<0.01)。組間兩兩比較的結果表明，黃體酮治療組與模型組以及溶劑治療組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；說明經黃體酮治療后腦部室管膜下區的神經干細胞增殖數量明顯增多，骨髓單核細胞不但具有神經營養作用，亦具有促進自體神經干細胞動員的能力。

3 討論

細胞移植治療有利于神經功能的恢復，對腦血管病具有潛在的治療價值。動物實驗研究結果表明，骨髓源性細胞是對腦梗死具有很高治療價值的眾多來源細胞中的一種。骨髓源性細胞主要包括骨髓基質干細胞(Bone marrow stromal cells BMSCs)與骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)。骨髓基質干細胞是具有多種分化潛能的干細胞，該細胞移植可以減輕腦梗死后神經功能的缺損；且具有分離簡單、不良反應少等缺點。然而骨髓基質干細胞的培養過程較為復雜，自體來源骨髓基質干細胞在急性及亞急性缺血性腦血管病患者的臨床應用方面受到很大的限制。單核細胞在骨髓中亦占有一定的比例，骨髓單核細胞的成分主要包括間質細胞及造血細胞[5]。將骨髓單核細胞用于缺血性腦血管病治療方面的研究目前在國內外鮮有報道。

脊椎動物腦部具有增殖能力的神經前體細胞主要位于前腦側腦室附近的室管膜下區(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下區(SGZ)，這些前體細胞具有分化為神經樣細胞的能力、并行使一定的生理功能。神經營養因子家族的成員包含BDNF等，已有研究闡述了BDNF在腦梗死后神經發生過程中的作用。已有研究發現，將經BDNF轉染的腺病毒通過立體定位注射的方式導入腦內，可以促進SGZ區神經干細胞的增殖，有助于神經發生及神經功能的恢復[6]。另有研究表明，經BDNF治療的大鼠，其紋狀體、下丘腦等腦室周圍組織內新生神經元的數量顯著明顯[7]。所有上述研究均說明中樞神經系統內神經的發生與BDNF的神經營養作用密切相關。通過BDNF側腦室注射除增加了SVZ區神經的發生外，亦在沿側腦室和第三腦室排列的紋狀體、隔區、下丘腦和海馬中等特殊皮質結構發現BrdU陽性細胞數目均明顯增多，且在上述區域新產生的神經細胞可表達神經元特異性標志物(Neun)和微管相關蛋白MAP2等。以上體內外實驗研究均表明，BDNF促進神經發生的作用是其它類型神經營養因子所不能代替的，且通過提升BDNF的表達促進神經的發生可能對腦梗死的治療具有重大意義[6]。

另有研究表明，中樞神經系統內神經的發生與腦梗死后神經功能的恢復關系密切[8-9]；該研究表明骨髓單個核細胞既促進了腦部神經營養因子的釋放及室管膜下區神經干細胞的增殖，提示骨髓單個核細胞可能對腦梗死具有突出的治療價值。關于骨髓單個核細胞促進BDNF分泌的可能機制尚有待于進一步的研究，如果骨髓單個核細胞在腦梗死方面的基礎研究能夠得到進一步的證實，必將為骨髓單個核細胞的臨床應用提供更多理論依據。

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(收稿2016-04-20)

The influence of auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells on proliferation of neural stem cells insubventricular zone in rats with cerebral infarction

JiangChao，KongWeixia，ZhuLi，LuoHuan

DepartmentofNeurology，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective Our study aimed at investigating the effects of bone marrow mononuclear cells(BMMNCs)on brain-derived neurotrophic factors(BDNF)and on proliferation of neural stem cells in subventricular zone in rats with cerebral infarction，in order to explore the potential mechanisms of BMMNCs on cerebral infarction．Methods Totally 72 adult male Sprague-Dawley rats weighing 250 to 300 g were used in this study．We performed thread occlusion technique to establish the model of cerebral infarction．Mononuclear cells(MNCs)isolated from femoral marrow cavity were separated by using density-gradient centrifugation method and the purity of selected cells was identified by flow cytometer．Then the separated MNCs were transplanted into rats via tail vein injection．The expression of BDNF in brain was detected by Western blotting method at 24h and 74h after stroke and proliferation of neural stem cells in subventricular zone was tested by double BrdU/Nestin immunofluorescence staining on the seventh day after stroke．Results At 24 h and 72 h after auto-transplantation with bone marrow mononuclear cells，the expression of BDNF in transplantation group was obviously increased and showed statistical differences compared with model group and solvent group(allP<0.05)．Proliferation of neural stem cells in subventricular zone in the transplantation group was significantly improved，which presented statistical differences relative to both model group and solvent group(allP<0.05)．Conclusion BMMNCs can not only significantly increase the expression of BDNF but also effectively improve proliferation of neural stem cells in subventricular zone．The improvement of BMMNCs may be closely associated with the protective effect of BMMNCs．

Cerebral infarction；BMMNCs；Brain-derived neurotrophic factor；Neural stem cells；Neurotrophic effect

R-332

A

1673-5110(2016)20-0009-03