基于RAPD標記的新疆荒漠稻區稻水象甲遺傳多樣性分析

王小武，付開赟，丁新華，吐爾遜·阿合買提，何江，郭文超

(1.石河子大學農學院，新疆石河子 832000；2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

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基于RAPD標記的新疆荒漠稻區稻水象甲遺傳多樣性分析

王小武1，付開赟2，丁新華2，吐爾遜·阿合買提2，何江2，郭文超2

(1.石河子大學農學院，新疆石河子 832000；2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

【目的】研究新疆荒漠稻區稻水象甲種群的遺傳結構及入侵途徑，為稻水象甲的監測、有效控制提供參考?！痉椒ā坎捎肦APD分子標記，對新疆各稻區及內地北方典型稻區7個不同地理種群105頭稻水象甲個體的遺傳多樣性進行分析?！窘Y果】28條RAPD隨機引物中篩選出7條多態性好的引物，共擴增出139條條帶，多態性條帶為98條，其多態性位點百分率(PPB)為70.5%。新疆伊寧察縣稻水象甲地理種群基因多樣性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龍江阿城最高(PPB：62.58%、H：0.300 6、I：0.445 0)；7個地理種群之間的Gst(基因分化系數)為 0.199 5，稻水象甲各種群間遺傳變異為19.95%，種群內遺傳變異為80. 05%，不同地理種群間遺傳分化水平較高。7個地理種群的UPGMA聚類結果顯示：河北唐山市和吉林公主嶺市的地理種群優先聚在一起，其親緣關系最近，接著依次與黑龍江阿城市、新疆伊寧察布查爾縣及霍城縣完成第一個聚類；新疆烏魯木齊市米東區和新疆五家渠市則完成第二個聚類?！窘Y論】稻水象甲不同地理種群遺傳多樣性不同且存在差異。新疆荒漠稻區稻水象甲隨引種、稻草、交通工具等人為的從東北傳入的可能性大。

稻水象甲：RAPD：遺傳分化

0 引 言

【研究意義】稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel產于美國南部地區[1]，該蟲繁殖力強、適生性強、傳播快速，防控難度大，故被國際自然保護聯盟(IΜCN)列為最具威脅的100種外來入侵生物之一[2]，也是我國重要的對外檢疫性對象之一[3]。1988年在我國河北省唐?？h發現[4]，隨后該蟲便在我國迅速傳播擴散，截止2010年，其疫區已擴大到23個省(直轄市和自治區)[5]，依次為臺灣、天津、北京、山東、遼寧、吉林、福建、浙江、湖南、安徽、江西、江蘇、廣東、廣西、山西、陜西、云南、內蒙古、黑龍江、湖北、貴州和新疆等，且有進一步向周邊省份蔓延的趨勢，對我國及稻米生產帶來了威脅。【前人研究進展】有關稻水象甲的研究，國內外學者大多集中于其生物學、生態學和綜合防治等方面，如：關志堅[6]、郭文超[7-8]、NILAKHESS[9]、孫富余[10]、王小武[11]等對稻水象甲生物學特性及其種群遷移擴散規律進行了研究；王剛[12]、翟保平[13]、LEE[14]等對稻水象甲生活習性、生活史、及遷飛影響因子的研究；黃雅文[15]對稻水象甲空間分布型的研究。孫富余[10]、付文君[16]、班曉麗[17]等進行了稻水象多種防控措施的研究。以上研究雖對稻水象甲的有效防控起到了積極作用，但仍未能遏制稻水象甲的傳播蔓延。因此，很有必要進行稻水象甲種群的遺傳分化情況研究，探討其入侵傳播擴散的分子機制。目前，有關稻水象甲遺傳多樣性研究，在國內僅見少量報道。李志強[18]運用RAPD-PCR技術分析了遼寧省不同地域稻水象甲的遺傳多樣性以探明該物種在遼寧省內的傳播途徑；柳青[19]等采用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記技術分析了我國內地13個省28個地區稻水象甲的遺傳多樣性，楊璞[20]利用AFLP對兩種生殖方式稻水象甲種群多態性進行了研究，結果表明，兩性生殖和孤雌生殖類群的相似系數較低，兩者的親緣關系較遠。在分子標記技術中，RAPD (random amplified polymorphic)最早是由Black應用于蚜蟲的種及種群鑒定和區分[21]。目前，RAPD分子標記技術已應用在寄生蜂、舞毒蛾、棉鈴蟲、蚜蟲、按蚊、蝗蟲、果蠅、粉虱、蜜蜂等昆蟲中，因其操作簡單、對引物沒有嚴格的界限、對樣品DNA的質量要求不高且不需事先知道材料的基因信息，故其已成為昆蟲遺傳結構研究中的一種普遍方法[22]，而涉及稻水象甲RAPD分子標記的研究在新疆尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關稻水象甲遺傳多樣性研究，在國內僅見少量報道。選取RAPD分子標記技術開展新疆各稻區稻水象甲不同地理種群間，及其與內地北方典型稻區種群遺傳結構、遺傳多樣性進行研究，揭示新疆荒漠稻區稻水象甲種群的遺傳結構及入侵途徑。【擬解決的關鍵問題】通過對新疆各稻區稻水象甲不同地理種群間及其與內地北方典型稻區稻水象甲進行RAPD分子標記，揭示新疆稻區稻水象甲種群的遺傳結構及入侵途徑，指導新疆科學制定稻水象甲的封鎖與防控措施，進一步有效阻止或延緩其傳播擴散提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗以稻水象甲成蟲為材料，分別采集于我國4個省份7個地理種群。樣本采集后置于-80℃冰箱保存以備用。表1

表1 供試稻水象甲信息來源
Table 1 The specimens tested of Lissorhoptrus oryzophilus

序號No．地理種群代碼CodeofPopulation采集地Location樣本個數Samplesize經度Lon緯度Lat1HLJAC黑龍江阿城市151270945232JIGZL吉林公主嶺市151244343263HBTS河北唐山市151183739574XJYNQapqal新疆伊寧市察布查爾縣15812043905XJMD新疆烏魯木齊市米東區15876843776XJYNHC新疆伊寧市霍城縣15814443467XJWJQ新疆五家渠市158732444

1.2 方 法

1.2.1 稻水象甲DNA提取

稻水象甲總DNA的提取利用FFPE DNA Kit固定組織基因組DNA提取試劑盒(Cwbio)完成。具體步驟：(1)將單頭成蟲稻水象甲后放入小型研磨中，加入180 μL Beffer GTL和20 μL Proteinase K研磨。(2) 56℃ 孵育1 h，直至樣品完全溶解；90℃孵育1 h，短暫離心。(3)加入200 μL Buffer GL,渦旋震蕩，加入200 μL無水乙醇，渦旋震蕩，短暫離心。(4)將步驟(3)所得溶液全部加入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DS)中。10 000 r/min離心1 min，棄廢液。(5)加入500 μL Buffer GW1，10 000 r/min離心1 min，棄廢液。(6)加入500 μL Buffer GW2，1 000 r/min離心1 min，棄廢液。(7)12 000 r/min離心2 min，棄廢液，靜置數分鐘。(8)將吸附柱置于新的離心管，加入20～100 μL Beffer GE或滅菌水，室溫放置2～5 min，10 000 r/min離心1 min，收集DNA溶液，-20℃保存備用。

1.2.2 RAPD標記

從28條隨機引物(Biomed)中篩選出7條多態性強、重復性較好的引物，并用這7條引物，對7個地理種群稻水象甲總DNA進行RAPD-PCR。RAPD反應體系為25 μL，其中包括10.5 μL ddH2O ，12.5 μL 2xTaqPCR Master Mix(Cwbio)，1 μL模板DNA，1 μL引物。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；3個循環：94℃變性1 min，42℃退火1.5 min ，72℃下延伸2 min。隨后進行第二次循環；共40個循環：94℃變性1 min，45℃1.5 min，72℃延伸2 min。循環結束后于72℃條件下完全延伸9 min。 PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，染料為GoldView I型核酸染色劑(zomanbio)，Marker為DL2000(Cwbio)，電泳條件為100 V，45 min，隨后在 Image Lab凝膠成像系統上檢測拍照。

1.3 數據統計

用RAPD隨機引物擴增出的每一個基因型、片段/條帶均視為一個分子標記，凝膠圖譜上的條帶按有帶或弱帶賦值“1”，無帶的賦值“0”，形成二進制“0，1”矩陣，用POPGENE 1.32軟件計算不同地理種群遺傳多樣性參數?；贜ei's遺傳距離，按UPGMA (不加權成對算術平均法) 法對不同地理種群進行聚類分析[21]。

2 結果與分析

2.1 RAPD引物篩選及PCR擴增結果

對7個地理種群105頭稻水象甲個體進行RAPD-PCR分析。研究表明，從28條RAPD隨機引物中篩選出7條多態性較好的引物，擴增出139條條帶，每條引物平均擴增條帶19.85條，多態性條帶16條，多態性位點百分率(PPB)為70.5%。其中OPP11擴增總條帶數最多，為26條，OPE-1多態性條帶數最多，為21條；引物OPO18擴增總條帶數最少，為10條，引物OPO18多態性條帶數最少，為7條。OPE-1多態性位點百分率最高，達84.0%，G13最低，為52.4%。7條引物均獲得較為理想的DNA圖譜。表2，圖1，圖2

表2 RAPD引物序列及其擴增
Table 2 RAPD primer sequences and amplification resμlts

引物Primer序列(5＇to3＇)Sequence(5＇to3＇)擴增總帶數Numberofamplifiedbands多態性條數Numberofpolymorphicbands多態性位點百分率(%)PercentageofpolymorphismbandsA16AGCCAGCGAA16138125G13CTCTCCGCCA21115240OPE-1CCCAAGGTCC252184OPE-3GGTGCGGGAA24166667OPO18CTCGCTATCC10770P2GTTTCGCTCC17116471OPP11AACGCGTCGG26197308

圖1 引物a16對五家渠地理種群擴增的RAPD帶型

Fig.1 RAPD bands of XJWJQ population samples of using primer a16

圖2 引物ope-1對察布查爾縣地理種群擴增的RAPD帶型

Fig.2 RAPD bands of XJCX population samples of using primer a16

2.2 稻水象甲地理種群遺傳多樣性

稻水象甲7個不同地理種群的遺傳多樣表明，新疆伊寧察布查爾縣地理種群基因多樣性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龍江阿城最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)。表3

7個地理種群之間的Gst(基因分化系數)為 0.199 5，稻水象甲各種群間遺傳變異為19.95%，種群內為80.05%，種群內的遺傳分化水平較高，種群內基因多樣性Hs為0.269。其種群間基因流Nm 為 2.006 8。表4

表3 稻水象甲種群遺傳多樣性
Table 3 Genetic diversity of Lissorhoptrus oryzophilus populations

地理種群Geographicalpopulation等位基因數(Na)Numberofalleles有效等位基因數(Ne)EffectivenumberofallelesNei＇s基因多樣性指數(H)Nei＇sindexShannon信息多樣性指數(I)Shannon＇sindex多態位點數No．ofpolymorphicloci多態位點百分率(%)PPBHLJAC18878±0380615016±0347503006±0159204450±02423876258JIGZL18265±0317314819±0325602850±0176304285±02139825899HBTS18367±0371514474±0342702699±0170604123±02330785612XJYNQapqal16633±0475013402±0329002106±0180703239±02606654676XJMD18265±0380614878±0349002872±0177904310±02441785612XJYNHC18061±0397414807±0360302817±0181504225±02500815827XJWJQ17959±0405114029±0330302482±0170903825±02383795684Average18061±0389614489±0340602690±0173904080±02403795684SpeciesLevel19764±0214515472±0256703361±0108905119±01281987050

注：表中數據均為平均值±標準差，下同

Notes：Date in the Table are mean ±SE, the same as below

表4 由Nei's指數估計的稻水象甲種群遺傳分化系數及基因流
Table 4 Coefficients of the genetic diversity and gene flow of Lissorhoptrus oryzophilus popμlations by Nei's index

總基因多樣性(Ht)Totalgeneticdiversity種群內基因多樣性(Hs)Geneticdiversitywithinpopulations基因分化系數(Gst)Coefficientofgeneticdifferentiation基因(Nm)Geneflow03361±001190269±000770199520068

2.3 稻水象甲地理種群的聚類分析

由稻水象甲不同地理種群間Nei's遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)可得：7個地理種群中，新疆烏魯木齊市米東區和黑龍江阿城市地理種群相似度最低為0.876 3，而河北唐山市和吉林公主嶺市最高為0.949 7；河北唐山市和吉林公主嶺市的遺傳距離最近為0.051 6，黑龍江阿城市和新疆伊寧市霍城縣的最遠為0.133 7。根據Nei's(1978)遺傳距離數據，構建7個地理種群的UPGMA聚類系統樹，研究表明，吉林公主嶺市、河北唐山市、黑龍江阿城市、新疆伊寧市察布查爾縣及新疆伊寧霍城縣5個地理種群完成第一個聚類，形成第一個分支，其中河北唐山市和吉林公主嶺市的地理種群優先聚在一起，表明其親緣關系最近，接著依次與黑龍江阿城市、新疆伊寧察布查爾縣及新疆伊寧霍城縣的分支完成第一個聚類；新疆烏魯木齊市米東區和新疆五家渠市則完成第二個聚類。表5，圖3

表5 稻水象甲不同地里種群間Nei's遺傳一致度(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)
Table 5 Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

popID12345671????090860903008748087710932109017200958????092740936708802094970885630102100754????090590906509159090274013370065400988????087630931408764501311012760098201321????089520903060070300516008790071001107????091527010350121501024013190102000886????

圖3 稻水象甲Nei's (1978)遺傳距離系統樹
Fig.3 The dendrogram Based Nei's (1978) Genetic distance for Lissorhoptrus oryzophilus

3 討 論

3.1 新疆稻區與我國東北水稻產區基本處于同一緯度區域，熱量資源相同，種植模式相同，均是一年一季；再者新疆稻區大多品種主要引自東北地區[23]，而河北唐山是稻水象甲最初入侵地，東北地區和河北地區均屬于我國典型的水稻種植區，因此判斷，新疆稻區的稻水象甲可能由上述地區入侵。故研究采用RAPD標記對7個地理種群稻水象甲(均采自北方典型稻區)進行了遺傳特性分析，結果表明，稻水象甲不同地理種群多態位點百分率(%) PPB 、Nei's基因多樣性指數(H)、Shannon's多樣性信息指數(I)均不同，其中黑龍江阿城市地理種群的遺傳多樣性最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)，而新疆伊寧察布查爾縣地理種群的遺傳多樣性最低(PPB : 46.76%、H: 0.210 6、I:0.322 9)。表明我國新疆和北方典型稻區不同地理種群中，稻水象甲的種群遺傳多樣性豐富度不同且存在遺傳差異。這一結論與柳青[19]等研究類似。

3.2 Nei's遺傳多樣性指數估計的稻水象甲7個地理種群之間的基因分化系數Gst為0.199 5，表明各地理種群間的遺傳變異為19.95%，種群內的遺傳變異為80.05%，種群內的遺傳分化水平較高；這一研究結果與柳青等[19]研究結果相反，其認為稻水象甲種群間的遺傳分化水平較高。上述有關導致稻水象甲成蟲在我國不同地區遺傳分化差異的原因還有待于進一步研究。

3.3 聚類分析結果顯示，7個地理種群聚成兩大分支。其中，新疆伊犁河谷地區察布查爾縣和霍城縣聚在第一個分支，新疆烏魯木齊市米東區和新疆五家渠市聚成第二個分支，四個地理種群并未聚到一起。這表明新疆的稻水象甲可能存在不同來源，烏魯木齊市米東區和五家渠市兩個地理種群來源于同一區域，而伊犁河谷地區察布查爾縣和霍城縣的兩個地理種群為同一個來源。而且據調查，2010年前后伊犁河谷察布查爾縣曾在東北稻水象甲發生區引進過水稻種子。因此，伊犁河谷地區稻水象甲來源于東北吉林省或黑龍江省可能性較大，而烏魯木齊市米東區和五家渠市兩個地理種群來源于我國其他稻水象甲發生區。從發生時間順序上看，新疆稻區四個地理種群屬同一來源的可能性更大。

3.4 齊國君等[5]認為；稻水象甲首先入侵港口城市，其次出現于鐵路/公路沿線城市；柳青等[19]研究表明，在我國稻水象甲擴散路線是復雜的且呈多向性。對于研究而言，稻水象甲在我國擴散主要受人為因素、交通貿易影響較大(如引種、稻草)。從聚類的結果看，吉林公主嶺市和河北唐山市的地理種群優先聚類，其親緣關系最近，接著依次與黑龍江阿城市、新疆伊寧察布查爾縣及霍城縣的分支完成聚類，最后和新疆米東區、五家渠市的地理種群聚類。因此，推測新疆地區的稻水象甲可能是隨引種、稻草、交通工具等人為的從東北傳入。

4 結 論

4.1 對7個地理種群105頭稻水象甲個體進行RAPD-PCR分析。結果表明，從28條隨機引物中篩選出7條多態性好的引物，共擴增出139個條帶，平均每條引物擴增條帶為19.85條，多態性條帶為16條，多態性位點百分率(PPB)為70.5%。

4.2 稻水象甲7個不同地理種群的遺傳多樣。新疆伊寧市察布查爾縣地理種群基因多樣性最低(PPB：46.76%、H：0.210 6、I：0.323 9)，黑龍江阿城市最高(PPB：62.58 %、H：0.300 6、I：0.445 0)。7地理種群之間的基因分化系數Gst 為 0.199 5，稻水象甲各種群間遺傳變異為19.95%，種群內為80.05%。種群間基因流Nm為2.006 8，各地理種群間遺傳分化水平較高。

4.3 稻水象甲7個地理種群的UPGMA聚類結果顯示：吉林公主嶺市、河北唐山市、黑龍江阿城市、新疆伊寧市察布查爾縣及霍城縣5個地理種群完成第一個聚類，形成第一個分支；新疆烏魯木齊市米東區和新疆五家渠市則完成第二個聚類，形成第二個分支。表明新疆稻區的稻水象甲可能存在不同來源，烏魯木齊市米東區和五家渠市兩個地理種群來源于同一區域，而伊犁河谷地區察布查爾縣和霍城縣的兩個地理種群為同一個來源。伊犁河谷地區稻水象甲來源于東北吉林省或黑龍江省可能性較大，而烏魯木齊市米東區和五家渠市兩個地理種群來源于我國其他稻水象甲發生區。從發生時間順序上看，新疆稻區不同地理種群屬同一來源的可能性更大。

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Fund project:The national key research project "The dynamic distribution and resource database construction of the main invading organisms"(2016YFC1202100); the basic science and technology research support funds of non-profit research institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "rice water weevil monitoring and control techniques of green control technology research" (KY2015061), the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "rice water weevil adaptability and genetic analysis in Xinjiang diversity "(xjnkq-2014003)

Analysis on Genetic Diversity of the Rice Water Weevil Based on RAPD Markers in the Ecological Regions of Oasis in Xinjiang

WANG Xiao-wu1, FU Kai-yun2, DING Xin-hua2, Tuerxun·Ahemaiti2, HE Jiang2, GUO Wen-chao2

(1.College of Agronomy, Shihezhi University, Shihezi Xinjiang 832000, China; 2. Key Laboratory ofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The objective of this experiment is to study the genetic structure and invasive route ofL.oryzophilusin the hope of providing references that might be important for accurate monitoring and effective control of rice weevils.【Method】TheL.oryzophiluswere collected from 7 different geographic populations of 105 individual from Xinjiang and north typical rice planting areas in China which was analyzed by using the RAPD molecular markers in order to investigate the genetic diversity of the populations.【Result】7 good polymorphic RAPD primers that was finally-screened from 28 the random primers produced a total of 139 bands, of which 98 were polymorphic. The Polymorphism loci percentage(PPB)was 70.5% . The genetic diversity of the XJYNQ -apqal populations was the lowest (PPB：46.76%,H：0.210,6,I：0.323,9)，while HLJAC was the highest (PPB：62.58 %,H：0.300,6,I：0.445,0)The coefficient of genetic differentiation among populations Gst was 0.199,5, including 19.95% genetic variation partitioned among populations, 80.05% within populations. It was showed higher levels of genetic differentiation between different geographic populations. 7 geographical populations of UPGMA clustering results showed that: Tangshan City in Hebei Provice, Gongzhuling in Jilin Province, Hebei City, the geographical population is a priority, which indicated the close genetic relationship. Followed by are Acheng City in Heilongjiang Provice and Qapqal and Huocheng County in Yili area. These places completed the first cluster, while the other populations in Wujiaqu city and Midong district constituted the second cluster.【Conclusion】The richness of genetic diversity of theL.oryzophilusdifferent geographic populations is different and have genetic difference in China. The rice water weevil,L.oryzophilusKuschel in the ecological regions of oasis in Xin-jiang were probably invaded from Northeast rice planting areas in China in the course of introduction, such as straws and traffic tools by the people.

LissorhoptrusoryzophilusKusche；RAPD；genetic differentiation

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.11.014

2016-05-04

國家重點研發計劃項目“主要入侵生物的動態分布與資源庫建設”(2016YFC1202100)；自治區公益性科研院所基本科研業務費專項項目“稻水象甲監測及綠色防控技術研究”(KY2015061)；新疆農業科學院青年基金項目“稻水象甲在新疆的適生性分析及遺傳多樣性研究”(xjnkq-2014003)

王小武(1990-)，男，寧夏人，碩士研究生，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治，(E-mail)wxw303528@163.com

郭文超(1966-)，男，河北人，研究員，研究方向為害蟲生物防治和農業外來入侵生物防控技術，(E-mail)gwc1966@163.com

S435.112.6

A

1001-4330(2016)11-2069-08